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Notch信号通路是一种普遍存在于从果蝇到哺乳动物等众多生命体中具有高度保守性的关键信号通路，其功能是参与细胞发育、增殖、分化、凋亡、黏附及器官发育。Notch信号通路是由Notch受体、Notch配体和CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag的合称）-DNA结合蛋白3部分组成。Notch受体和配体均在细胞膜上表达。Notch受体胞外区是配体结合并激活Notch受体的部位，Notch受体胞内区(Notch intracellular domain，NICD)为其活性成分，未成熟的Notch受体与邻近细胞配体结合后被激活，经过3次裂解产生活性成分NICD。而关键的裂解发生在S3位点，即由γ分泌酶介导的切割作用而产生NICD。当NICD进入核内后，激活下游靶基因的转录。近年来，许多研究结果发现Notch信号通路失调与包括胰腺癌在内的多种肿瘤的发生、发展过程密切相关，在这些肿瘤中发现Notch通路持续活化[1-5]。(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT）是一种γ分泌酶抑制剂，能够通过阻断Notch信号通路，抑制肿瘤细胞的生长、转移和侵袭[6-7]。本研究以DAPT为前体进行体外细胞学实验，合成11C-N-甲基-DAPT(简称11C-DAPT)，初步研究其在正常新西兰兔体内的动态分布，为进一步开展此类肿瘤特异性显像剂的转化研究及指导同类肿瘤分子靶向药物的治疗奠定基础、提供依据。
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人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2由德国海德堡大学Freiss.H教授惠赠。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS均购自美国Hyclone公司；DAPT购自美国Selleck公司；二甲基亚砜购自美国Sigma/Aldrich公司。NucleoCounter NC-100型全自动细胞计数仪购自丹麦chemometec公司；Sep-Pak QMA SPE分离柱购自美国Waters公司。使用美国GE公司的MINItrace Ⅱ回旋加速器、TRACERlab FXC Pro合成模块和Elite PET/CT。
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普通级雄性新西兰兔1只，3月龄，体质量3 kg，许可证编号：SYXK(京，2015-0025)。
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人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2培养于DMEM培养液（加10%胎牛血清），在37℃、5% CO2培养箱中传代3代以上进行实验。经传代后的人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2用0.25%胰酶进行消化，用DMEM培养液制成单个细胞悬液，用全自动细胞计数仪计数，调整细胞浓度至3×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔体积100 μL。在37℃ 5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，吸出培养液，分别加入不同浓度梯度的DAPT（30、45、60、70、80、90、 120 μmol/L）和CH3-DAPT（10、20、40、80、120、160、200 μmol/L）溶液，二者均溶于DMEM培养液。同时设置对照组和空白组，对照组加入相同体积的DMEM培养液，空白组无细胞只加培养液。DAPT和CH3-DAPT（实验组）均设5个复孔。37℃ 5% CO2培养箱中培养72 h。CCK-8法测定每组各孔的光密度（optical density，OD）值。
$ {\text{抑制率}}(\%)=1-{\frac{OD{\text{值}({\text{实验}})}-{\rm{OD}}{\text{值}}({\text{空白}})}{OD{\text{值}({\text{对照}})}-{\rm{OD}}{\text{值}}({\text{空白}})}}\times 100\% $ 使用SPSS19.0软件对数据进行logit回归分析，并计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)
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回旋加速器生产11C-CO2，在全自动合成仪上经H2还原得到11C-CH4，11C-CH4与I2反应生成11C-CH3I后转入反应瓶；2 mg前体DAPT溶于0.4 mL二甲基亚砜，预先置于反应瓶中，加入7 μL 5 mol/L NaOH ，充分振荡混匀。11C-CH3I与DAPT混合，标记反应80℃，反应时间3 min，洗脱液终止反应，降温冷却至35°C。产物使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪进行分离纯化（C18柱，洗脱液300 mL 30%乙醇，流速2.5 mL/min，紫外线254 nm），收集产物，生理盐水稀释，无菌滤膜过滤待用。11C-DAPT的合成路线见图1。
图 1 11C-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）的合成路线图
Figure 1. Radiosynthetic route of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)
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新西兰兔1只，耳缘静脉注射125.8 MBq（3.4 mCi）11C-DAPT后用PET/CT进行动态扫描，0、7、14、21、28 min各采集1次，共5次。CT扫描参数：电压120 kV，电流150 mA，层厚5 mm；PET扫描参数：1 min/床位，共4个床位。扫描结束后，对原始图像采用OSEM图像重建技术进行重建。获得CT、PET及二者融合图像。在主要脏器勾画ROI，测量放射性浓度（kBq/mL）及其随时间的变化。
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CCK-8法检测结果显示，DAPT和CH3-DAPT对胰腺癌细胞株MIAPaCa-2增殖的抑制作用呈剂量依赖关系。DAPT和CH3-DAPT作用于胰腺癌细胞株MiaPaCa-2后72 h，细胞增殖的IC50分别为64.2 μmol/L和180.0 μmol/L。
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11C-DAPT整个合成过程大约30 min，放射化学产率25%~35%（未校正，3次重复试验），放射化学纯度>95%。HPLC检测11C-DAPT与12C-DAPT标准品保留时间一致，大约在5.3 min时（图2、3）。
图 2 12C-DAPT标准品的HPLC保留时间图 图中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色谱。
Figure 2. Retention time of reference substance 12C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in analytic HPLC
图 3 11C-DAPT HPLC纯化后的保留时间图 图中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色谱。
Figure 3. Retention time of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) purified by preparative HPLC
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兔注射11C-DAPT后，体内吸收迅速，以肾脏分布较多，肝脏、肠道、肺、脑等脏器摄取较低。7 min时肝脏、肾脏摄取达到高峰，28 min后降低>50%（表1）。注射后即刻扫描，肠道、脑及肺的放射性摄取达到高峰，随时间延长逐渐降低。0~21 min，随时间延长，膀胱的放射性摄取逐渐增高。兔喉部前方可见放射性摄取增高组织，且随时间延长摄取逐渐降低，但受PET/CT分辨率的影响，无法明确具体器官来源。图4和图5显示注射 11C-DAPT后正常兔的PET/CT图像。
组织 ROI 的放射性浓度 (kBq/mL) 0 min 7 min 14 min 21 min 28 min 脑 38.3±1.53 26.6±0.58 23.3±0.58 16.0±1.00 14.0±0.00 肺 40.6±2.52 28.3±2.08 20.0±2.64 12.6±1.52 12.3±0.58 肝脏 57.0±1.73 66.7±0.58 50.3±0.58 45.3±1.57 30.0±1.00 肠道 43.3±3.51 35.0±3.00 27.3±1.53 21.3±1.53 16.7±0.58 肾脏 83.7±3.06 123.6±5.69 75.3±2.31 65.0±2.65 51.6±3.06 膀胱 2.3±0.58 3.3±1.15 29.7±0.58 60.0±0.00 49.7±0.58 注：表中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；ROI：感兴趣区。 表 1 11C-DAPT在正常新西兰兔体内的生物学分布（
$\bar x \pm s$ Table 1. Biodistribution of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in normal New Zealand rabbit
图 4 新西兰兔注射11C-DAPT后不同时间的PET冠状位图像 图中，A：0 min；B：7 min；C：14 min；D：21 min；E：28 min。DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯。
Figure 4. Coronal PET images of New Zealand rabbit at different time point after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)
图 5 新西兰兔注射11C-DAPT 14 min后的PET/CT冠状位图像 图中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯。
Figure 5. Coronal PET, CT and fusion images of New Zealand rabbit at 14 min after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester
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近年来有研究结果发现，多种恶性肿瘤的发生、发展与持续活化Notch信号通路相关[8]。另外，Notch信号通路能够促进癌症干细胞的形成和上皮间质转化，并与肿瘤耐药性密切相关，通过药物性阻断该通道能够抑制肿瘤的生长、克服化疗药物耐药性[9-11]。Notch信号通路药物性阻断剂包括单克隆抗体、γ分泌酶抑制剂、小分子干扰RNA和天然化合物。其中γ分泌酶抑制剂靶向药为目前最被广泛及深入研究的Notch信号通路药物性阻断剂，包括RO4929097、MK-0752和DAPT等[11-12]。
胰腺癌为消化系统较常见的恶性肿瘤，5年生存率低于5%[13]。胰腺癌对放化疗不敏感，目前手术是治疗胰腺癌最有效手段，大约60%的胰腺癌患者在确诊时已发生远处转移，25%为局部晚期患者，且不能进行根治切除术[14]。因此，寻找和建立早发现、早诊断的方法，开发靶向治疗药物，成为提高胰腺癌诊疗效果的主攻方向之一。临床前研究结果证实，DAPT能够抑制胰腺癌细胞的生长、促进凋亡，与化疗药物联合使用可以提高化疗效果[6-7, 15]。本研究观察了不同浓度的DAPT对人胰腺癌细胞系MiaPaca-2增殖的影响，结果发现DAPT对该细胞株增殖的抑制作用呈剂量依赖性关系，与杜潇等[6]研究结果一致；同时使用CH3-DAPT作用于MiaPaca-2细胞，结果表明其对该细胞株的增殖亦有抑制作用。虽然CH3-DAPT的抑制作用弱于DAPT，但说明CH3-DAPT未改变DAPT的生物学特性，仍可作用于胰腺癌细胞，发挥抑制增殖作用，为11C-DAPT作为分子探针进行胰腺癌的显像提供了理论依据。
11C标记的分子探针通常是将11C-CH3标记到有机化合物中，是PET放射性药物合成的重要手段之一。本研究使用11C标记DAPT，不会引起原生物分子化学性质的变化，而且方法灵活、过程简单。查阅国内外相关文献，未见关于Notch信号通路抑制剂分子探针的报道，考虑到DAPT具有3个甲基化取代位点，更容易被标记，所以选择以DAPT作为前体，整个合成过程由合成器自动完成，经过多次实验、分析，发现将淋洗液乙醇浓度调整为30%时，合成效率为25%~30%，放射化学纯度大于95%。整个合成过程简单、快速，放射化学纯度高。本研究的分布实验结果显示，注射11C-DAPT后药物快速分布于各脏器，在肾脏摄取最多，肝脏摄取较少，肠道、脑和肺摄取低。在7 min时肝脏和肾脏放射性浓聚达到高峰，28 min时降低>50%。而膀胱内放射性摄取随时间的增加逐渐增多，这说明11C-DAPT主要通过肾脏排泄，在体内清除快。胰腺和脾脏因体积较小，且与邻近肠道组织难以区分，勾画ROI较困难，未测量放射性浓度。但是从图像观察，除了肾脏，腹腔内其他脏器放射性摄取较低，具有较低的本底，为进行胰腺病变的研究奠定了基础。另外，本研究还发现喉部前方软组织内可见较高的放射性摄取，随时间延长逐渐降低，通过PET/CT大体的定位，考虑为颌下腺的可能性大，并且文献报道Notch信号通路调节唾液腺的发育以及再生，Notch1~4受体在唾液腺细胞表面均有表达[16-17]。在后续的实验中，将用小鼠做离体测量，通过测量各器官（包括胰腺、脾脏、颌下腺等）的放射性计数，进一步明确11C-DAPT的生物学分布。
综上，本研究体外细胞实验结果证明，DAPT甲基化未改变DAPT的生物学特性，仍能够作用于胰腺癌细胞，抑制其增殖，在此基础上本研究成功制备了基于Notch信号通路抑制剂的分子探针11C-DAPT，合成过程简便、快速，放射化学纯度高，生物学分布提示11C-DAPT在肝脏、肠道的摄取低，为11C-DAPT进行胰腺癌的显像奠定了基础。我们下一步将建立胰腺癌皮下移植瘤动物模型，观察胰腺癌对11C-DAPT的摄取情况，进一步探索11C-DAPT作为胰腺癌新型靶向分子探针的可能性。
利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。
作者贡献声明 张姝负责实验的实施、论文的撰写；靳晓娜负责细胞实验的指导；党永红负责放射性药物标记实验的指导；霍力、李方负责命题的提出与论文的审阅。
Notch信号通路小分子抑制剂DAPT的11C标记及在正常兔体内的初步动态显像研究
11C-labeling DAPT a small-molecular inhibitor of the Notch signaling pathway, and preliminary imaging study of dynamic distribution in a normal rabbit
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摘要:
目的 研究正电子核素11C标记Notch通路抑制剂（3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）的制备方法，并进行正常兔PET/CT的初步动态显像。 方法 采用细胞计数Kit-8法检测不同浓度DAPT和CH3-DAPT对人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2增殖的影响，并计算半抑制浓度（IC50）。以DAPT为前体，使用全自动合成仪进行合成，得到产物11C-N-甲基-DAPT(简称11C-DAPT)，并用高效液相色谱（HPLC）仪进行分离纯化。正常新西兰兔静脉注射125.8 MBq（3.4 mCi）11C-DAPT后，用PET/CT进行全身动态扫描。在不同器官勾画感兴趣区，测量放射性浓度随时间的动态变化。 结果 DAPT和CH3-DAPT均可抑制人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的增殖，呈浓度依赖关系，72 h的IC50分别为64.2、180.0 μmol/L。11C-DAPT合成过程大约30 min，未校正放射化学产率为25%～35%，放射化学纯度>95%。11C-DAPT主要经肾脏排泄，全身脏器中肾脏摄取最高，肝脏、肠道、肺和脑摄取低。静脉注射后7 min肝脏、肾脏摄取达到高峰，28 min后降低>50%。 结论 11C-DAPT的合成过程简便、快速，放射化学纯度高。PET/CT的初步显像为进一步探索11C-DAPT作为胰腺癌新型靶向分子探针奠定了基础。 -
关键词:
- 同位素标记 /
- 正电子发射断层显像计算机体层摄影术 /
- Notch信号通路 /
- γ分泌酶抑制剂 /
- (3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯 /
- 分子探针
Abstract:Objective To label N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT), an inhibitor of the Notch signaling pathway, with 11C and perform preliminarily dynamic imaging in normal rabbit. Methods Proliferation of human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2 were assessed by cell counting kit-8 method after treatment with various concentrations of DAPT and CH3-DAPT. Half-maximal inhibitory concentration(IC50) was calculated. DAPT was then used as a precursor to prepare 11C-N-methyl-DAPT(11C-DAPT) with a fully automatic synthesizer. The final product was purified through semipreparative high performance liquid chromatography(HPLC). After intravenous injection of 125.8 MBq(3.4 mCi) 11C-DAPT, a normal New Zealand rabbit was subjected to dynamic whole-body PET/CT scanning. The dynamic changes in radioactivity were measured by drawing regions of interest over different organs. Results DAPT and CH3-DAPT concentration-dependently inhibited the growth of the human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2. The IC50 values were 64.2 and 180.0 μmol/L at 72 h after administration, respectively. 11C-DAPT was synthesized for approximately 30 min. The uncorrected radiochemical yield was 25%–35%. Radiochemical purity was above 95%. 11C-DAPT was mainly excreted through the kidney, the highest uptake was in the kidneys, and the uptake in the liver, intestine, lung, and brain was relatively low. The tracer uptake in the kidneys and liver peaked at 7 min after injection and decreased to >50% at 28 min. Conclusions 11C-DAPT can be easily and rapidly synthesized with high radiochemical purity. Preliminary PET/CT imaging can lay a foundation for further investigating 11C-DAPT as a novel molecular probe. -
图 1 11C-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）的合成路线图
Figure 1. Radiosynthetic route of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)
图 2 12C-DAPT标准品的HPLC保留时间图 图中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色谱。
Figure 2. Retention time of reference substance 12C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in analytic HPLC
图 3 11C-DAPT HPLC纯化后的保留时间图 图中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色谱。
Figure 3. Retention time of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) purified by preparative HPLC
图 4 新西兰兔注射11C-DAPT后不同时间的PET冠状位图像 图中，A：0 min；B：7 min；C：14 min；D：21 min；E：28 min。DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯。
Figure 4. Coronal PET images of New Zealand rabbit at different time point after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)
图 5 新西兰兔注射11C-DAPT 14 min后的PET/CT冠状位图像 图中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯。
Figure 5. Coronal PET, CT and fusion images of New Zealand rabbit at 14 min after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester
表 1 11C-DAPT在正常新西兰兔体内的生物学分布（
$\bar x \pm s$ Table 1. Biodistribution of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in normal New Zealand rabbit
组织 ROI 的放射性浓度 (kBq/mL) 0 min 7 min 14 min 21 min 28 min 脑 38.3±1.53 26.6±0.58 23.3±0.58 16.0±1.00 14.0±0.00 肺 40.6±2.52 28.3±2.08 20.0±2.64 12.6±1.52 12.3±0.58 肝脏 57.0±1.73 66.7±0.58 50.3±0.58 45.3±1.57 30.0±1.00 肠道 43.3±3.51 35.0±3.00 27.3±1.53 21.3±1.53 16.7±0.58 肾脏 83.7±3.06 123.6±5.69 75.3±2.31 65.0±2.65 51.6±3.06 膀胱 2.3±0.58 3.3±1.15 29.7±0.58 60.0±0.00 49.7±0.58 注：表中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；ROI：感兴趣区。 
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