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人血管内皮生长因子（human vascular endothelial growth factor，hVEGF）是一种具有高度生物活性的二聚体阳离子糖蛋白[1]，它特异性地作用于血管内皮细胞，使其增殖、迁移，并能促进血管形成和增加毛细血管通透性。肿瘤新生血管的生成是在hVEGF的调控下进行的。肿瘤新生血管的活跃程度是影响肿瘤细胞增殖的重要因素，而hVEGF是促进肿瘤新生血管生成最重要的生长因子之一，故其可反映肿瘤的发生、发展和转移[2-4]。测定血清中hVEGF的含量，对肿瘤的早期筛查、治疗疗效观察、复发监测及相关抗肿瘤药物疗效评价等都具有一定的参考价值[5-6]。目前hVEGF的检测方法主要有酶联免疫吸附法和荧光免疫层析法等[7-8]。但酶联免疫吸附法的灵敏度相对较低，荧光免疫层析法在定量检测中的批间变异性较大，不适宜在临床检测中推广。化学发光免疫测定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）法是目前最先进的免疫分析技术之一，其灵敏度高，批内和批间变异性小，更适合在临床检测中使用[9-12]。本研究旨在研制以磁微粒为载体的hVEGF放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）和CLIA试剂盒，评价其分析灵敏度、回收率和精密度等技术指标，并通过对临床血清样本的检测探讨2种试剂盒对早期肿瘤的诊断价值 。
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hVEGF抗原购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；hVEGF抗体购自天健生物制药（天津）有限公司；液体生物防腐剂 Proclin300购自默克化工技术（上海）有限公司；Na125I由中国同位素公司代购自美国PerkinElmer公司；吖啶酯购自湖北新德晟材料科技有限公司；磁微粒购自杭州博岳生物技术有限公司；RIA仪[型号G（-911）]购自科大创新股份有限公司中佳分公司；全自动CLIA仪（型号SMART500s）购自重庆科斯迈生物科技有限公司；4-吗啉乙磺酸（4-morpholinoethanesulfonic acid，MES）缓冲液和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；葡聚糖G-25凝胶柱购自上海源叶生物科技有限公司；NaCO3、NaHCO3、NaCl、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸二钠、HCl、NaOH、蔗糖均购自天津市风船化学试剂科技有限公司；海藻糖购自上海蓝季科技发展有限公司；Tween 20购自天津市光复科技发展有限公司；甘氨酸、碳二亚胺、Na2S2O3、氯胺T和H2O2均购自默克化工技术（上海）有限公司；胎牛血清购自上海羽哚生物科技有限公司；超声波清洗机（型号JPS-20AL）购自深圳市洁泰超声洗净设备有限公司；旋转混合仪（型号Bit1000-S）购自杭州瑞诚仪器有限公司；脱盐柱（型号PD-10）购自武汉晶诚生物科技股份有限公司。实验中所检测的正常人及肺癌和结直肠癌患者血清样本均由山西省肿瘤医院提供。
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将0.02 mol/L、pH=7.3的PBS与胎牛血清按2∶1比例配制成hVEGF标准品基础缓冲液（简称零标准品），用此缓冲液配制质量浓度分别为0、100、400、1 000、3 000、10 000 pg/ml的hVEGF抗原标准品。该hVEGF抗原标准品可同时用于RIA和CLIA。
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配制0.01 mol/L、pH=7.0的MES缓冲液作为磁微粒连接液；在1 L磁微粒连接液中加入10 g甘氨酸作为磁微粒封闭液；在1 L 0.02 mol/L、pH=7.3的 PBS中加入10 g BSA、10 g蔗糖、1 ml液体生物防腐剂 Proclin300作为磁微粒保存液。取1 ml磁微粒加入离心管中，用磁微粒连接液洗涤2次，加入5 ml磁微粒连接液并经超声分散后，再加入1 mg hVEGF抗体，在旋转混合仪上旋转反应0.5 h；加入10 mg/ml的碳二五胺溶液500 μl，经超声分散后在旋转混合仪上旋转反应3 h；加入5 ml磁微粒封闭液旋转过夜进行磁分离；磁分离后，用MES缓冲液洗涤2次，加入10 ml磁微粒保存液并经超声分散，制备成磁微粒悬浮液。使用时将包被抗体后的磁微粒悬浮液稀释40倍作为磁微粒工作液，此磁微粒工作液可同时用于RIA和CLIA。
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放射免疫标记：取0.1 mg hVEGF抗体，加入55.5 MBq Na125I，用磁力转子边搅拌边加入4.0 mg/ml的氯胺T 30 μl反应45 s后，立即加入4.0 mg/ml的Na2S2O3 50 μl反应30 s。用葡聚糖G-25凝胶柱纯化分离。在1 L 0.02 mol/L、pH=7.3的 PBS中，加入10 g BSA和1 ml液体生物防腐剂 Proclin300，配制成PBS-BSA缓冲液，用PBS-BSA缓冲液配制hVEGF标记抗体工作液，使100 μl hVEGF标记抗体的每分钟放射性计数（CPM）约为20万，4℃保存备用，此即为RIA标记物工作液。
化学发光免疫标记：取0.2 mg hVEGF抗体，加入4 ml标记反应液（0.05 mol/L、pH=9.0的由NaCO3和NaHCO3配制的碳酸盐缓冲液），用超滤管离心使得体积为200 μl，在玻璃试管中，边用磁力转子搅拌边加入6.3 μl 4 mg/ml的吖啶酯溶液，避光搅拌反应3 h，加入标记终止液（1 mol/L的甘氨酸溶液）100 μl反应0.5 h。用脱盐柱纯化，用PBS-BSA缓冲液洗脱收峰（吖啶酯标记完抗体后，用脱盐柱进行层析纯化，收集蛋白峰），使其总体积为20 ml。向1 L 0.05 mol/L、pH=6.8的柠檬酸盐缓冲液中加入BSA 8 g、海藻糖5 g、乙二胺四乙酸二钠2 g、NaCl 8.5 g配制成hVEGF标记物缓冲液，用此缓冲液将hVEGF标记抗体再稀释50倍，于棕色不透明瓶中4℃避光保存，此即为CLIA标记物工作液。
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激发液Ⅰ：1 L双蒸水中加入2.5 ml 浓HCl和2 ml 30% H2O2，充分混匀后4℃避光保存。激发液Ⅱ：1 L双蒸水中加入10 g NaOH，充分混匀后4℃保存。免疫测定洗涤液：0.01 mol/L、pH=7.3的 PBS，含0.1% Tween 20，常温保存。
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上述组份制备完成以后，进行RIA和CLIA对比实验，确定RIA和CLIA试剂盒的操作方法和温育条件。
RIA试剂盒操作方法：分别取50 μl hVEGF抗原标准品和人血清样本、50 μl磁微粒工作液、100 μl RIA标记物工作液至反应管，室温振荡1 h（300 次/min），磁分离后用免疫测定洗涤液洗涤2次，用RIA仪进行测定。
CLIA试剂盒操作方法：分别取50 μl hVEGF抗原标准品和人血清样本、50 μl磁微粒工作液、50 μl CLIA标记物工作液至反应管，37℃温育20 min，用免疫测定洗涤液洗涤4次，加入100 μl激发液Ⅰ和100 μl激发液Ⅱ，用CLIA仪进行测定。
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分别用RIA和CLIA试剂盒连续测定20管零标准品，统计其每分钟放射性计数值和发光值，计算
$\bar x $'/> 和SD，取$\bar x $'/> +2SD在标准曲线上所对应的浓度值即为RIA和CLIA试剂盒的分析灵敏度。 -
批内变异性：将hVEGF抗原溶解于人血清中，配制成质量浓度分别为100、1000 pg/ml的低、高2个血清样本，用2种试剂盒分别进行测定，每个样本测20次，计算hVEGF浓度的
$\bar x $'/>'/>'/> 和SD，然后计算变异系数（CV）=$\bar x $'/>'/>'/> /SD×100%。批间变异性：将hVEGF抗原溶解于人血清中，配置成质量浓度分别为100、1000 pg/ml的低、高2个血清样本各10管，用2种试剂盒分别进行测定，重复测3次，计算3次测定的hVEGF浓度$\bar x $'/>'/>'/> 、SD和CV。 -
将hVEGF抗原溶解于人血清中，配制成质量浓度分别为100、500、3000 pg/ml的低、中、高3个血清样本，用RIA和CLIA试剂盒分别测定其浓度，然后计算实际测定值与理论值之间的比值，即为回收率。回收率越接近100%，准确率越高。
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收集106名正常人血清样本，用RIA和CLIA试剂盒分别测定hVEGF浓度，计算
$\bar x $'/> 和SD，然后计算$\bar x $'/> +2SD即为正常参考值范围的上限，小于该值为正常。 -
用2种试剂盒分别测定处于Ⅰ期或Ⅱ期的52例肺癌、56例结直肠癌患者的血清样本中hVEGF浓度，计算其灵敏度；测定106名正常人血清样本，计算其特异度。对测定结果进行对比分析。
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应用SPSS 25.0软件对正常人与肺癌、结直肠癌患者hVEGF测定值进行统计学分析，计量资料以均数表示，组间比较采用两独立样本t检验（方差齐）。P<0.05为差异有统计学意义。
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由RIA和CLIA试剂盒测定hVEGF抗原标准品的结果可知，hVEGF抗原抗体结合较好，非特异性结合低，各标准品浓度的发光值梯度明显，2种试剂盒测定的标准曲线线性良好（图1、图2）。因此，磁微粒与包被抗体的最佳比例为1 ml磁微粒∶1 mg 抗体；125I与标记抗体的最佳比例为55.5 MBq 125I∶0.1 mg抗体，吖啶酯与标记抗体的最佳比例为25 μg吖啶酯∶0.2 mg抗体。
图 1 放射免疫测定试剂盒测定人血管内皮生长因子抗原标准品的标准曲线
Figure 1. Standard curve of human vascular endothelial growth factor antigen detected by radioimmunoassay kit
图 2 化学发光免疫测定试剂盒测定人血管内皮生长因子抗原标准品的标准曲线
Figure 2. Standard curve of human vascular endothelial growth factor antigen detected by chemiluminescence immunoassay kit
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RIA试剂盒检测20管零标准品，计算得到的每分钟放射性计数
$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> =844.35、SD=147.63、$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> +2SD=1139.61；CLIA试剂盒检测20管零标准品，计算得到的发光值$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> =8109.20、SD=1142.87、$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> +2SD=10394.95。将$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> +2SD结果取整后带入标准曲线，得到RIA和CLIA试剂盒的分析灵敏度分别为17.6和9.2 pg/ml。 -
RIA试剂盒的批内变异性分别为5.95%和4.19%，批间变异性分别为7.85%和7.06%；CLIA试剂盒的批内变异性分别为6.12%和4.35%，批间变异性分别为7.96%和6.37%。
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RIA和CLIA 2种试剂盒对低、中、高3个血清样本进行测定的平均回收率分别为103.28%和101.85%，说明CLIA试剂盒检测的准确率更高。
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RIA试剂盒测定正常人血清样本中hVEGF浓度，计算得到
$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> =99.82 pg/ml、SD=20.53、$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> +2SD=140.88；CLIA试剂盒测定正常人血清样本中hVEGF浓度，计算得到$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> =102.35 pg/ml、SD=19.59、$\bar x $'/>'/>'/>'/>'/>'/>'/> +2SD=141.53。因此将RIA和CLIA试剂盒测定hVEGF的正常参考值统一确定为<142 pg/ml。 -
由表1可知，每种试剂盒检测肺癌患者和结直肠癌患者分别与正常人血清样本hVEGF测定值均值相比，差异均有统计学意义（t=−16.695~−14.920，均P<0.01）。RIA试剂盒和CLIA试剂盒检测出肺癌、结直肠癌灵敏度分别为90.38%（47/52）和92.31%（48/52）、92.86%（52/53）和91.07%（51/56）；RIA试剂盒和CLIA试剂盒检测出正常人血清样本的特异度分别为98.11%（104/106）和99.06%（105/106）。
血清样本来源 试剂盒 测定值>正
常参考值
样本数（例）hVEGF
浓度均值
（pg/ml）灵敏度
（%）特异度
（%）肺癌患者（n=52） RIA 47 378.65a 90.38 − CLIA 48 389.52a 92.31 − 结直肠癌患者（n=56） RIA 52 458.39a 92.86 − CLIA 51 469.18a 91.07 − 正常人（n=106） RIA 2 99.82 − 98.11 CLIA 1 102.35 − 99.06 注：a表示与正常人血清样本hVEGF浓度均值相比，差异均有统计学意义（t=−14.929、−14.920、−16.695、−16.415，均P<0.01）；−表示无此项数据。RIA为放射免疫测定；CLIA为化学发光免疫测定 表 1 RIA和CLIA 2种试剂盒测定临床血清样本中人血管内皮生长因子的结果分析
Table 1. Analysis of the results of determination of human vascular endothelial growth factor in clinical serum samples by RIA and CLIA kits
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癌症给人类的生命健康造成了严重威胁。我国每年约有150万人患癌症，约80万人因癌症病死，且发病率和病死率均呈逐年上升趋势。癌症患者病死率居高不下的主要原因是早期症状不明显，发现时已至晚期，错过了治疗时机。癌症具有器官特异性，目前研究成熟的肿瘤生物标志物一般只对部分肿瘤敏感，做一次全面体检需要测十几种肿瘤生物标志物，费用高且检测过程复杂。因此非常有必要选择一种对所有肿瘤都灵敏的生物标志物用于体检普通筛查。而hVEGF是肿瘤新生血管生成最重要的促进因子之一，在肿瘤发生过程中出现早，且对所有肿瘤都敏感，因此对早期肿瘤诊断具有重要意义[13-16]。
本研究制备了以磁微粒为固相载体的RIA试剂盒和CLIA试剂盒，对其检测hVEGF的分析灵敏度、精密度、回收率等技术指标进行了评价，探讨其在早期肺癌和结直肠癌临床诊断中的价值。本研究结果显示，CLIA试剂盒的分析灵敏度高于RIA试剂盒。在精密度方面，CLIA试剂盒的批内变异性略高于RIA试剂盒，而批间变异性略低于RIA试剂盒。在准确率方面，与RIA试剂盒相比，CLIA试剂盒检测的准确率更高。在临床样本检测方面，CLIA试剂盒对肺癌的临床检测灵敏度略高于RIA试剂盒；RIA试剂盒对结直肠癌的临床检测灵敏度略高于CLIA试剂盒；CLIA试剂盒检测正常人血清样本的特异度略高于RIA试剂盒。由于所使用的抗原抗体完全相同，RIA试剂盒和CLIA试剂盒的临床检测结果相差不大。
综上，CLIA试剂盒的分析灵敏度、特异度均高于RIA试剂盒，精密度和临床血清样本检测结果与RIA试剂盒基本相当。从试剂成本来看，CLIA试剂盒的标记抗体用量约为RIA试剂盒的一半，成本相对较低。CLIA试剂盒可由全自动CLIA仪完成操作，温育时间为20 min；而RIA试剂盒需人工操作，温育时间为1 h，因此CLIA试剂盒操作更加快速便捷。另外，RIA试剂盒的有效期约为45 d，而CLIA试剂盒的有效期可达1年，且放射免疫试剂有一定的放射性污染，而化学发光试剂则更加环保。因此，CLIA试剂盒的优势更加明显，有利于市场推广。总之，本研究研制的2种试剂盒的各项技术指标较好，具有较高的性价比，这与文献[17-18]报道一致，其在早期肺癌和结直肠癌临床检测中具有一定的临床价值。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 王立凯负责方法学的建立、论文的撰写；范文红负责临床试验方案的设计及实施；杨思思负责数据的处理和统计分析、论文的修改；邓德文负责放射免疫测定现场实验；谌红彬负责化学发光免疫测定现场实验；张文杰负责实验方案的总体设计、论文的审阅
两种人血管内皮生长因子免疫测定试剂盒的研制及其对早期肿瘤的诊断价值探讨
Development of two kinds of human vascular endothelial growth factor immunoassay kits and their diagnostic value in early tumor
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摘要:
目的 研制人血管内皮生长因子（hVEGF）放射免疫测定（RIA）试剂盒和化学发光免疫测定（CLIA）试剂盒，探讨其在早期肺癌和结直肠癌诊断中的价值。 方法 以2种试剂盒的技术指标为参考依据建立检测方法，确定磁微粒包被抗体的工艺方法及125I和吖啶酯标记抗体的工艺方法，并评价2种试剂盒的分析灵敏度、精密度、回收率。通过检测临床癌症（早期肺癌和结直肠癌）患者和正常人血清样本中的hVEGF，评价2种试剂盒对早期肿瘤诊断的灵敏度和特异度。2组间的比较采用两独立样本t检验。 结果 磁微粒与包被抗体的最佳比例为1 ml磁微粒∶1 mg 抗体；125I与标记抗体的最佳比例为55.5 MBq 125I∶0.1 mg抗体，吖啶酯与标记抗体的最佳比例为25 μg吖啶酯∶0.2 mg抗体。RIA和CLIA试剂盒的分析灵敏度分别为17.6、9.2 pg/ml。在精密度方面，CLIA试剂盒的批内变异性略高于RIA试剂盒，而批间变异性略低于RIA试剂盒。RIA和CLIA试剂盒的平均回收率分别为103.28%和101.85%，说明CLIA试剂盒检测的准确率更高。在临床样本检测方面，2种试剂盒对早期肺癌和结直肠癌的临床诊断灵敏度和特异度均可达90%以上。RIA试剂盒和CLIA试剂盒检测出正常人血清样本的特异度分别为98.11%（104/106）和99.06%（105/106）。癌症患者与正常人hVEGF测定值相比，差异均有统计学意义（t=−16.695~−14.920，均P<0.01）。 结论 2种试剂盒各项技术指标较好，其中CLIA试剂盒的分析灵敏度和特异度更高，在早期肺癌和结直肠癌的诊断中具有一定的临床价值。 Abstract:Objective To prepare human vascular endothelial growth factor (hVEGF) radioimmunoassay (RIA) and chemiluminescence immunoassay (CLIA) kits and evaluate their clinical value in diagnosis of early lung cancer and colorectal cancer. Methods A detection method was established according to the technical indices of the kits. The techniques for coating magnetic particles and 125iodine and acridine ester labeling with antibody were evaluated. Sensitivity, precision, and recovery of the kits were determined. The sensitivity and specificity of the kits in the diagnosis of early cancers (lung and colorectal cancers) were evaluated by testing cancer and normal serum samples. Independent sample t-test was used for inter-group comparison. Results The optimal ratios were as follows: 1 mL of magnetic particles to 1 mg of the antibody, 55.5 MBq 125iodine to 0.1 mg of the antibody, and 25 μg acridine ester to 0.2 mg of the antibody. The detection sensitivities of RIA and CLIA kits were 17.6 and 9.2 pg/mL respectively. For precision, the CLIA kit had slightly higher intra-batch variability and lower inter-batch variability than the RIA kit. The mean recovery levels of the RIA and CLIA kits were 103.28% and 101.85% respectively, and the latter had higher detection accuracy. The clinical sensitivity and specificity in the diagnosis of lung cancer and colorectal cancer were all above 90%. RIA kit and CLIA kit showed that the specificity of hVEGF in normal serum samples was 98.11% (104/106) and 99.06% (105/106), respectively.. There were significant differences in hVEGF between cancer patients and normal subjects (t=−16.695–−14.920, all P<0.01). Conclusions The technical indices of the hVEGF RIA and CLIA kits were good. The CLIA kit had higher sensitivity and specificity than the RIA kit and has clinical value in screening and auxiliary diagnosis of early lung and colorectal cancers. -
图 1 放射免疫测定试剂盒测定人血管内皮生长因子抗原标准品的标准曲线
Figure 1. Standard curve of human vascular endothelial growth factor antigen detected by radioimmunoassay kit
图 2 化学发光免疫测定试剂盒测定人血管内皮生长因子抗原标准品的标准曲线
Figure 2. Standard curve of human vascular endothelial growth factor antigen detected by chemiluminescence immunoassay kit
表 1 RIA和CLIA 2种试剂盒测定临床血清样本中人血管内皮生长因子的结果分析
Table 1. Analysis of the results of determination of human vascular endothelial growth factor in clinical serum samples by RIA and CLIA kits
血清样本来源 试剂盒 测定值>正
常参考值
样本数（例）hVEGF
浓度均值
（pg/ml）灵敏度
（%）特异度
（%）肺癌患者（n=52） RIA 47 378.65a 90.38 − CLIA 48 389.52a 92.31 − 结直肠癌患者（n=56） RIA 52 458.39a 92.86 − CLIA 51 469.18a 91.07 − 正常人（n=106） RIA 2 99.82 − 98.11 CLIA 1 102.35 − 99.06 注：a表示与正常人血清样本hVEGF浓度均值相比，差异均有统计学意义（t=−14.929、−14.920、−16.695、−16.415，均P<0.01）；−表示无此项数据。RIA为放射免疫测定；CLIA为化学发光免疫测定 
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