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随着核技术的发展，电离辐射被广泛应用于医疗、工业和农业等领域，其在造福人类的同时也极大地增加了人们受到辐射损伤的风险[1]。短时间内大剂量的电离辐射会引发机体的急性辐射综合征，造成造血系统、胃肠道系统、生殖系统和皮肤等的辐射损伤[1-4]。其中，机体造血系统对电离辐射尤为敏感，而造血系统的恢复在辐射损伤的治疗中至关重要[1, 5]。几十年来，辐射防护药物的开发一直是国内外科研工作者研究的热点。然而，高效、低毒和稳定性好的造血系统辐射防护药物的开发仍然是一个未解决的问题，开展这方面的研究迫在眉睫。
中药以其靶点多、促进造血、增强免疫功能和抗氧化等多种优势在辐射损伤的治疗中发挥着重要的作用。黄杞叶为胡桃科黄杞属植物黄杞（Engelhardia roxburghiana Wall.）的干燥叶，是广西壮族人常用的中药，具有抗炎、抗肿瘤和增强免疫功能等多种药理作用[6-7]。本研究所采用的黄杞叶提取物的主要成分是黄酮类化合物，其占黄杞叶提取物总量的64%，落新妇苷、黄杞苷和花旗松素3种二氢黄酮是其中的主要活性成分，分别占黄酮类化合物总量的57.9%、3.3%、2.8%[7]。落新妇苷广泛存在于多种药用和食用植物中，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用[8-9]，对溶骨性骨病[10]、糖尿病肾病[11]、脓毒症诱导的急性肺损伤[12]、慢性炎症性皮肤病[13]、乳腺癌[14]等具有防护作用。黄杞苷主要存在于蔬菜和水果中，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等活性，对肺纤维化[15]、盆腔炎[16]和骨关节炎[17]等具有防护作用。花旗松素是一种天然化合物，存在于多种植物中，通常作为食品工业中的天然抗氧化添加剂，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性，对银屑病[18]和急性酒精性肝损伤[19]等具有防护作用，还可以促进肝癌细胞的凋亡[20]。辐射诱导的活性氧水平升高是导致造血系统损伤的主要原因[21]，黄杞叶提取物的主要活性成分具有极强的抗氧化能力，但是目前尚未发现黄杞叶提取物在辐射损伤研究中的相关报道。因此，我们探讨黄杞叶提取物对小鼠造血系统辐射损伤的防护作用，并对其作用机制进行初步的研究。
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黄杞叶提取物由中国医学科学院放射医学研究所新药开发研究室自制，根据前期优化后的提取与纯化工艺进行制备[7]。
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雄性C57BL/6小鼠100只，无特定病原体级，体重20~22 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[许可证号：SCXK（京）2019-0008]，饲养在中国医学科学院放射医学研究所无特定病原体级实验动物中心，饲养温度18~25℃，相对湿度 40%~60%，光明和黑暗每12小时交替一次。所有动物实验均获得中国医学科学院放射医学研究所动物伦理委员会的批准（批准号：IRM-DWLL-2021124）。
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全自动血液分析仪所用溶血剂、稀释液、清洗液、探头清洁液和E-Z清洁液均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒[2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）法]和二喹啉甲酸（BCA） 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自上海碧云天生物技术有限公司；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（微板法）购自南京建成生物工程研究所。
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Gammacell®40 Exactor 137Cs γ射线照射源购自加拿大Best Theratronics公司，剂量率为0.99 Gy/min；BC-2800vet全自动血液分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；Infinite F Plex 酶标仪购自瑞士Tecan公司；Evolution™ 201 紫外可见分光光度计购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司。
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配制200 μmol/L DPPH储备液，置于−20℃冰箱中避光保存。于96孔板每孔中加入20 μl不同质浓度的黄杞叶提取物待测样品（以无水乙醇配制，最终浓度分别为0.3、1、3、10、30、100、200 μg/ml），每组设置3个平行实验，以等量无水乙醇作为空白对照。以上每孔各加入180 μl 200 μmol/L DPPH储备液，室温下避光静置 30 min，使用酶标仪测定其在517 nm波长处的吸光度值。将黄杞叶提取物样品的吸光度值记为 A1，空白对照的吸光度值记为 A0。DPPH自由基的清除率=[(A0−A1)/A0]×100%。
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按照总抗氧化能力检测试剂盒说明书操作，配制ABTS工作母液（等体积ABTS溶液与氧化剂溶液混匀），室温避光16 h，使用前用80%乙醇稀释成ABTS工作液。于96孔板每孔中加入10 μl不同浓度的黄杞叶提取物样品（以80%乙醇配制，最终浓度分别为0.3、1、3、10、30、100、200 μg/ml），每组设置3个平行实验，以等量80%乙醇作为空白对照。以上每孔各加入200 μl ABTS 工作液，室温下避光静置 2 min，使用酶标仪测定其在405 nm波长处的吸光度值。将黄杞叶提取物样品的吸光度值记为 A1，空白对照的吸光度值记为 A0。ABTS自由基的清除率=[(A0−A1)/A0]×100%。
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将40只C57BL/6小鼠按照区组随机法平均分为4组：照射组、照射+黄杞叶提取物低剂量组（20 mg/kg）、照射+黄杞叶提取物中剂量组（40 mg/kg）、照射+黄杞叶提取物高剂量组（80 mg/kg），用于小鼠存活实验；将另外60只C57BL/6小鼠按照区组随机法平均分为6组：对照组、照射组、黄杞叶提取物高剂量组（80 mg/kg）、照射+黄杞叶提取物低剂量组（20 mg/kg）、照射+黄杞叶提取物中剂量组（40 mg/kg）、照射+黄杞叶提取物高剂量组（80 mg/kg），用于小鼠造血系统辐射损伤防护实验。
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对照组和照射组均给予0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na），其余各组分别给予相应剂量的黄杞叶提取物，根据小鼠体重按10 ml/kg灌胃。所有实验小鼠均于照射前7 d和照射后6 d连续灌胃给药。于每次给药0.5 h后开始照射，存活实验中需照射小鼠接受一次性全身 7.2 Gy（致死剂量） 137Cs γ 射线照射，造血系统辐射损伤防护实验中需照射小鼠接受一次性全身4 Gy 137Cs γ 射线照射。
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每隔一天记录各组实验小鼠的存活情况。照射后第30天处死全部存活小鼠，并对实验小鼠的存活率和存活天数进行分析。
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每隔一天记录各组实验小鼠的体重变化。照射后第7天于取血前测量各组小鼠体重，脱颈处死后摘取各组小鼠的脾脏和胸腺，测量重量后计算脾脏和胸腺的脏器指数，脏器指数=脏器重量（mg）/动物体重（g）。
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照射后第7天，经眼球摘除法收集小鼠血液于含有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）的抗凝管中，使用全自动血液分析仪分析各组小鼠外周血血常规各项指标的变化。
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照射后第7天，取小鼠右侧股骨，小心剔除股骨表面残留的肌肉和结缔组织后，PBS冲洗3次，用注射器吸取1 ml PBS冲洗骨髓细胞于1.5 ml离心管中，反复冲洗至少3次直至股骨发白，再经200目筛网过滤转移至另一个1.5 ml离心管中形成单细胞悬液，使用全自动血液分析仪检测各组小鼠单侧股骨中的BMNC数量。
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照射后第7 天，取小鼠左侧股骨，小心剔除股骨表面残留的肌肉和结缔组织后，PBS冲洗3次，用注射器吸取2 ml 5 mmol/L氯化钙冲洗骨髓细胞于15 ml 离心管中，反复冲洗至少 3次直至股骨发白，收集的骨髓悬液于4℃ 静置30 min后，2500 r/min （离心半径为 12 cm）离心15 min，弃掉上清，向沉淀中加入5 ml 0.2 mol/L高氯酸，混匀，90℃水浴加热15 min，冷却过滤，取1 ml于紫外可见分光光度计268 nm波长处测定吸光度值[用光密度（OD）值表示]。
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照射后第7天，摘取小鼠肝脏，剪下适量肝脏组织并称取放入备好的离心管中，按重量（g）∶体积（ml）=1∶9的比例加入预冷的PBS，将肝脏组织剪碎，于冰水浴条件下制备肝脏匀浆，3000 r/min（离心半径为 8 cm）离心10 min，取上清待测。用二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒检测肝脏组织中的蛋白含量，按照试剂盒说明书上的操作检测肝脏组织中的还原型GSH含量。
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应用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以
$\bar{x} \pm s$ 表示，在方差齐的条件下，组间两两比较采用Student t检验，小鼠的存活率采用Kaplan-Meier分析。P<0.05为差异有统计学意义。 -
由图1可见，随着黄杞叶提取物和Trolox（一种维生素E的类似物，具有与维生素E相近的抗氧化能力，用作其他抗氧化物总抗氧化能力的参考，即阳性对照）浓度的增加，其对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率逐渐增强直至趋于平缓，且呈现出良好的量效关系。当浓度较低时，黄杞叶提取物和Trolox的抗氧化能力较为接近。当浓度为100 μg/ml和200 μg/ml时，与Trolox相比，黄杞叶提取物对DPPH自由基的清除率更高（89.83%对69.37%，90.94%对68.53%），且差异均有统计学意义（t=19.58、33.26，均P<0.001）；对ABTS自由基的清除率也更高（94.81%对71.35%，94.46%对71.93%），且差异均有统计学意义（t=21.64、20.37，均P<0.001）。以上实验结果表明，黄杞叶提取物具有极强的体外抗氧化能力。
图 1 黄杞叶提取物对DPPH（A）和ABTS（B）自由基的体外清除能力
Figure 1. Scavenging effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (A) and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (B) free radicals in vitro
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由图2可见，在接受致死剂量照射后，与照射组相比，照射+黄杞叶提取物低、中、高剂量组小鼠开始出现死亡的时间均有所延缓，且30 d存活率均明显升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）；存活天数亦均有所增加[（19.40±7.70） d对（12.50±3.59） d、（20.20±8.48） d对（12.50±3.59） d、（20.90±7.96） d对（12.50±3.59） d ]，且差异均有统计学意义（t=2.57、2.79、3.04，P=0.019、0.012、0.007）。
图 2 黄杞叶提取物对7.2 Gy（致死剂量）137Cs γ射线照射后小鼠存活率的影响
Figure 2. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on survival rate of mice irradiated with 7.2 Gy (lethal dose) 137Cs γ-rays
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由图3可见，在接受全身一次性 4 Gy137Cs γ 射线照射后，受照小鼠的平均体重均呈现出先降低后升高的趋势。与对照组相比，在照射后第3、5、7 天，黄杞叶提取物高剂量组小鼠平均体重略高，但差异均无统计学意义（t=0.63、0.98、0.91，P=0.544、0.355、0.389）；照射组小鼠平均体重均明显降低，且照射后第1、3天，两组间的差异均有统计学意义（t=3.04、2.40，均P<0.05）。与照射组相比，照射+黄杞叶提取物低、中、高剂量组小鼠照射后体重下降少且恢复快，平均体重均高于照射组，但差异均无统计学意义（t=0.65~1.37，P=0.641~0.963）。以上实验结果表明，黄杞叶提取物几乎没有毒性且可缓解照射导致的小鼠体重降低。
图 3 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠体重的影响
Figure 3. Effect of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on body weight of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
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由图4可见，与对照组相比，黄杞叶提取物高剂量组小鼠脾脏和胸腺脏器指数的差异均无统计学意义（t=0.95、0.46，P=0.371、0.650）；照射组小鼠脾脏和胸腺脏器指数均明显降低，差异均有统计学意义（t=16.72、5.39，均P<0.001）。与照射组相比，照射+黄杞叶提取物各剂量组小鼠脾脏和胸腺脏器指数均有所升高，其中，照射+黄杞叶提取物低、中剂量组小鼠略有升高，但差异均无统计学意义（t=1.00~1.57，P=0.482~0.843），照射+黄杞叶提取物高剂量组小鼠升高最明显[（2.13±0.43） mg/g对（1.67±0.20） mg/g、（1.87±0.39） mg/g对（1.39±0.31） mg/g]，且差异均有统计学意义（t=3.00、3.03，均P<0.05）。以上实验结果表明，黄杞叶提取物对小鼠脾脏和胸腺无明显毒性，且可缓解照射诱导的小鼠脾脏和胸腺脏器指数的降低。
图 4 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠脾脏（A）和胸腺（B）的影响
Figure 4. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on spleen (A) and thymus (B) in mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
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由图5可见，与对照组相比，黄杞叶提取物高剂量组小鼠外周血各项指标的差异均无统计学意义（t=0.10~1.45，P=0.161~0.923）；照射组小鼠的WBC、RBC、血小板数量均明显减少，血红蛋白含量和淋巴细胞百分比均明显降低，中性粒细胞百分比明显升高，且差异均有统计学意义（t=5.54~15.14，均P<0.001）。与照射组相比，照射+黄杞叶提取物各剂量组WBC、RBC数量均明显增加，血红蛋白含量明显升高，其中，照射+黄杞叶提取物中剂量组小鼠RBC数量增加最为明显[（10.12±1.71）×1012/L 对（8.26±0.87）×1012/L]，且差异有统计学意义（t=2.89，P=0.042）；照射+黄杞叶提取物高剂量组小鼠WBC、RBC数量增加和血红蛋白含量升高最为明显[（1.76±0.45）×109/L对（1.17±0.23）×109/L、（9.59±0.85）×1012/L对（8.26±0.87）×1012/L、（144.40±14.61）g/L对（126.20±13.16）g/L]，且差异均有统计学意义（t=3.62、3.23、2.93，P=0.015、0.011、0.043）；照射+黄杞叶提取物各剂量组小鼠血小板数量、中性粒细胞和淋巴细胞的百分比有一些改善，但差异均无统计学意义（t=0.58~1.29，P=0.673~0.981）。以上实验结果表明，黄杞叶提取物对小鼠外周血无明显毒性，且可恢复部分照射诱导的小鼠外周血细胞的损伤。
图 5 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠外周血各项指标的影响
Figure 5. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on various indexes of peripheral blood of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
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由图6可见，与对照组相比，黄杞叶提取物高剂量组小鼠BMNC数量和骨髓DNA含量均无明显变化（t=1.10、0.03，P=0.282、0.980）；照射组小鼠BMNC数量和骨髓DNA含量均明显降低，且差异均有统计学意义（t=6.19、3.95，均P<0.001）。与照射组相比，照射+黄杞叶提取物各剂量组小鼠BMNC数量和骨髓DNA含量均有所升高，其中，照射+黄杞叶提取物高剂量组升高最为明显，且差异均有统计学意义（t=3.28、3.93，均P<0.05）。以上实验结果表明，黄杞叶提取物对小鼠BMNC和骨髓DNA几乎无毒性，且可缓解照射诱导的小鼠骨髓造血细胞的损伤。
图 6 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠BMNC数量及骨髓DNA含量的影响
Figure 6. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on the number of bone marrow nucleated cells and DNA content in bone marrow of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
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由图7可见，与对照组相比，黄杞叶提取物高剂量组小鼠肝脏还原型GSH含量无明显变化（t=0.67，P=0.512）；照射组小鼠肝脏还原型GSH含量明显降低，差异有统计学意义（t=5.08，P<0.001）。与照射组相比，照射+黄杞叶提取物各剂量组小鼠肝脏还原型GSH含量均有所升高，且照射+黄杞叶提取物高剂量组升高最为明显，差异有统计学意义（t=3.07，P<0.05）。以上实验结果表明，黄杞叶提取物对小鼠肝脏无明显毒性，且可能通过发挥其抗氧化作用来缓解辐射所致的小鼠肝脏损伤。
图 7 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠肝脏还原型GSH含量的影响
Figure 7. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on reduced glutathione content in liver of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
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电离辐射是指含有足以使物质原子或分子中的电子成为自由态，从而使这些原子或分子发生电离现象的能量的辐射（如X射线或γ射线照射、中子或α粒子的高速运动）[1, 22]。当生物机体受到电离辐射后，机体分子、细胞、组织、器官的形态和功能会发生明显改变，最终导致机体的辐射损伤。目前，氨磷汀是美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的唯一一个用于辐射防护的临床药物，但由于其半衰期很短、不良反应多、给药途径单一，导致临床上的应用受到了很大限制[23]。因此，开发新的辐射防护药物，以消除或最大限度地减少电离辐射造成的辐射损伤非常必要。
中药是我国传统医学的瑰宝，具有药源广、价格合理、不良反应小等优点。近年来，从中药中寻求高效、低毒的辐射防护药物成为了辐射防护领域研究的热点。有研究结果显示，从传统中药中提取的很多黄酮类化合物均有明显的辐射防护作用，且作用机制均被证实与其抗氧化能力有关[24-25]。众所周知，生物机体的造血系统对电离辐射尤为敏感，当生物机体受到电离辐射后，其造血系统的损伤主要与辐射诱导的活性氧水平升高有关[26-27]。本研究所用的黄杞叶提取物的主要成分是二氢黄酮类化合物，通过体外自由基清除实验证实了其具有极强的抗氧化能力。因此，我们推断黄杞叶提取物对电离辐射所导致的机体造血系统的损伤具有一定的防护和损伤恢复作用。
我们对实验小鼠进行了全身一次性7.2 Gy或4 Gy 137Cs γ射线照射，并对实验小鼠的存活率、体重、造血系统主要脏器（脾脏和胸腺）的脏器指数、肝脏还原型GSH含量、外周血血常规、BMNC数量等指标进行了检测和分析，初步评估了黄杞叶提取物对电离辐射所导致的机体造血系统损伤的防护和损伤恢复作用。本研究结果显示，黄杞叶提取物可以显著提高致死剂量照射下小鼠的30 d存活率，并延长小鼠的存活天数，这直观地反映出黄杞叶提取物的辐射防护作用。此外，黄杞叶提取物还可以缓解全身一次性4 Gy 137Cs γ射线照射导致的小鼠体重下降，且照射+黄杞叶提取物各剂量组小鼠的体重从照射开始至取材当天均高于照射组，这反映出黄杞叶提取物对照射小鼠辐射损伤防护作用的稳定性和可靠性。研究结果显示，电离辐射可对机体的造血系统造成严重的损伤，具体表现为外周血细胞及淋巴细胞减少，中性粒细胞增多[28]。我们计算了小鼠造血系统主要脏器的脏器指数，发现黄杞叶提取物可以提高受照小鼠血液循环系统器官中脾脏和胸腺的脏器指数，这表明黄杞叶提取物可以促进受照小鼠造血系统损伤的修复。而后我们对小鼠的外周血血常规各项指标进行了分析，结果显示黄杞叶提取物明显改善了受照小鼠的WBC、RBC数量和血红蛋白含量，然而，黄杞叶提取物对受照小鼠的血小板数量及淋巴细胞和中性粒细胞百分比并没有很好的改善作用，这也提示黄杞叶提取物缓解和修复辐射损伤的作用具有一定的局限性，我们推测这可能是由于中药疗程长、见效较慢，对黄杞叶提取物具体的用法、用量不精准以及给药时间较短所致，我们后续会进一步研究并进行优化完善。
研究结果显示，DNA 是电离辐射的主要靶点，电离辐射会导致机体 DNA 的严重损伤[29]。在本研究中，我们发现黄杞叶提取物可以很好地改善受照小鼠的BMNC数量和 DNA 含量的减少，这表明黄杞叶提取物可以缓解辐射诱导的 DNA 损伤，也证明了其对受照小鼠的BMNC数量的改善可能归功于其对辐射诱导的 DNA 损伤的防护作用，但具体原因和机制仍有待进一步研究。另外，还有研究结果显示，电离辐射可以通过产生活性氧间接诱导 DNA 损伤，最终导致细胞凋亡[30]。GSH 作为重要的还原剂，参与机体多种氧化还原反应，能够改善辐射诱导的活性氧增加[31]。因此，我们检测了实验小鼠肝脏中还原型GSH含量，发现黄杞叶提取物可以缓解受照小鼠肝脏中还原型GSH含量的降低，这表明黄杞叶提取物可能通过其抗氧化能力发挥辐射防护的作用，但具体机制还有待研究。
综上，本研究结果表明，黄杞叶提取物对小鼠造血系统的辐射损伤具有一定的防护作用，且抗氧化活性可能是其发挥辐射防护作用的机制之一，这为传统中药黄杞叶在辐射防护领域的应用奠定了一定的基础。然而，其发挥辐射防护作用的具体分子机制仍有待探究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 吴少华负责现场实验、数据统计、图表制作、论文的撰写与修改；常华杰、勾文峰负责现场实验；郭江红、宁洪鑫负责数据的统计与分析；李祎亮、侯文彬负责论文的审阅与修改
黄杞叶提取物对小鼠造血系统辐射损伤的防护作用
Protective effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on radiation injury of the hematopoietic system in mice
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摘要:
目的 研究黄杞叶提取物对一次性全身4 Gy 137Cs γ射线照射导致的小鼠造血系统辐射损伤的防护作用。 方法 （1）体外实验。采用1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）和2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基体外清除实验检测黄杞叶提取物的体外抗氧化能力。（2）体内实验。①存活实验。将40只无特定病原体（SPF）级雄性C57BL/6小鼠按照区组随机法平均分为4组：照射组、照射+黄杞叶提取物低剂量（20 mg/kg）组、照射+黄杞叶提取物中剂量（40 mg/kg）组、照射+黄杞叶提取物高剂量（80 mg/kg）组，4组均进行全身一次性7.2 Gy（致死剂量）137Cs γ射线照射，记录照射后30 d小鼠的存活情况。②造血系统辐射损伤防护实验。将60只SPF级雄性C57BL/6小鼠按照区组随机法平均分为6组：对照组、照射组、黄杞叶提取物高剂量组（80 mg/kg）、照射+黄杞叶提取物低剂量（20 mg/kg）组、照射+黄杞叶提取物中剂量（40 mg/kg）组、照射+黄杞叶提取物高剂量（80 mg/kg）组，其中对照组和黄杞叶提取物高剂量组不照射，其余4组均进行一次性全身4 Gy 137Cs γ射线照射。照射后第7天处死小鼠，取外周血进行血常规检测，取单侧股骨骨髓细胞进行骨髓有核细胞计数，取另一侧股骨骨髓细胞进行骨髓DNA含量检测，取胸腺和脾脏计算脏器指数，取肝脏检测还原型谷胱甘肽（GSH）含量。体内实验中各组小鼠均于照射前7 d和照射后6 d连续灌胃给药，其中对照组和照射组给予0.5% 羧甲基纤维素钠，其余各组给予相应剂量的黄杞叶提取物。组间两两比较采用 Student t 检验，存活率采用Kaplan-Meier生存分析。 结果 （1）在体外实验中，当浓度分别为100 μg/ml和200 μg/ml时，与Trolox相比，黄杞叶提取物对 DPPH自由基的清除率更高（89.83%对69.37%，90.94%对68.53%）；对ABTS自由基的清除率也更高（94.81%对71.35%，94.46%对71.93%），且差异均有统计学意义（t=19.58~33.26，均P<0.001）。（2）在体内实验中，与照射组相比，照射+黄杞叶提取物低、中、高剂量组小鼠30 d存活率均明显升高，且差异均有统计学意义（Kaplan-Meier生存分析，均P<0.05），存活天数亦均明显增加 [（19.40±7.70） d对（12.50±3.59） d、（20.20±8.48） d对（12.50±3.59） d、（20.90±7.96） d对（12.50±3.59） d ]，且差异均有统计学意义（t=2.57、2.79、3.04， 均P<0.05）；照射+黄杞叶提取物高剂量组小鼠脾脏和胸腺的脏器指数明显升高[（2.13±0.43） mg/g对（1.67±0.20） mg/g、（1.87±0.39） mg/g对（1.39±0.31） mg/g] ，且差异均有统计学意义（t=3.00、3.03，均P<0.05）；照射+黄杞叶中剂量组小鼠红细胞数量增加最为明显[（10.12±1.71）×1012/L 对（8.26±0.87）×1012/L]，且差异有统计学意义（t=2.89，P<0.05）；照射+黄杞叶提取物高剂量组小鼠白细胞、红细胞数量明显增加[（1.76±0.45）×109/L对（1.17±0.23）×109/L、（9.59±0.85）×1012/L对（8.26±0.87）×1012/L]，血红蛋白含量亦明显升高[（144.40±14.61） g/L对（126.20±13.16） g/L] ，且差异均有统计学意义（t= 3.62、3.23、2.93，均P<0.05）；此外，照射+黄杞叶提取物高剂量组小鼠骨髓有核细胞数量、骨髓DNA含量和肝脏还原型GSH含量均明显升高，且差异均有统计学意义（t=3.28、3.93、3.07，均P<0.05）。 结论 黄杞叶提取物对小鼠造血系统辐射损伤有一定的防护作用。 Abstract:Objective To study the protective effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on mice hematopoietic system injury caused by disposable systemic 4 Gy 137Cs γ-rays irradiation. Methods (1) In vitro experiment. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) free radical scavenging tests were used to detect the antioxidant activity of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract in vitro. (2) In vivo experiment. ①Survival experiment. Forty specific pathogen-free male C57BL/6 mice were divided into four groups following a randomized block design: irradiation group, irradiation+low dose, irradiation+middle dose, and irradiation+high dose groups of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract (20, 40, and 80 mg/kg, respectively). All four groups were irradiated with whole-body 7.2 Gy (lethal dose) 137Cs γ-rays at one time. The survival condition of mice 30 days after irradiation was recorded. ② Radiation protection experiment of the hematopoietic system. Sixty specific pathogen-free male C57BL/6 mice were divided into six groups following a randomized block design: control group, irradiation group, Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract high dose group (80 mg/kg), irradiation+low dose, irradiation+middle dose, and irradiation+high dose groups of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract (20, 40, and 80 mg/kg, respectively). The control group and the Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract high dose group (80 mg/kg) were not irradiated, while the four other groups were irradiated with whole-body 4 Gy 137Cs γ-rays at one time. On the 7th day after irradiation, the mice were killed, the peripheral blood was obtained for blood routine detection, and unilateral femoral bone marrow cells were obtained for bone marrow nucleated cells count. The bone marrow cells of the other femur were used for bone marrow DNA content detection, the thymus and spleen were taken to calculate organ index, and liver was sampled to detect the content of reduced glutathione (GSH). In the in vitro experiment, the mice in each group underwent continuous intragastric administration 7 days before and 6 days after irradiation, in which the control group and irradiation group were given 0.5% carboxymethylcellulose sodium, and the other groups were given corresponding doses of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract. Student's t test was applied to compare differences between two groups, and Kaplan-Meier survival analysis was used to determine the survival rate. Results (1) In the in vitro experiment, compared with Trolox, the scavenging rate of DPPH free radical by the Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract were higher (89.83% vs. 69.37%, 90.94% vs. 68.53%) when the concentration was 100 μg/ml and 200 μg/ml; and the scavenging rate of ABTS free radical was also higher (94.81% vs. 71.35%, 94.46% vs. 71.93%), and the differences were statistically significant (t=19.58–33.26, all P<0.001). (2) In the in vivo experiment, compared with the irradiation group, the 30-day survival rates of mice in the low, middle, and high dose groups of irradiation+Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract significantly increased after receiving lethal dose irradiation, and the differences were statistically significant (Kaplan-Meier survival analysis, all P<0.05); while the survival days also significantly improved ((19.40±7.70) d vs. (12.50±3.59) d, (20.20±8.48) d vs. (12.50±3.59) d, (20.90±7.96) d vs. (12.50±3.59) d), and the differences were statistically significant (t=2.57, 2.79, 3.04; all P<0.05). The spleen and thymus organ index increased significantly in the irradiation+high dose group of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract ((2.13±0.43) mg/g vs. (1.67±0.20) mg/g, (1.87±0.39) mg/g vs. (1.39±0.31) mg/g), and the differences were statistically significant (t=3.00, 3.03; both P<0.05). The number of red blood cells increased most significantly in the irradiation+middle dose group of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf ((10.12±1.71)×1012/L vs. (8.26±0.87)×1012/L), and the difference was statistically significant (t=2.89, P<0.05). The number of white blood cells and red blood cells and the hemoglobin content increased significantly in the irradiation+high dose group of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract ((1.76±0.45)×109/L vs. (1.17±0.23)×109/L, (9.59±0.85)×1012/L vs. (8.26±0.87)×1012/L, (144.40±14.61) g/L vs. (126.20±13.16) g/L), and the differences were statistically significant (t=3.62, 3.23, 2.93; all P<0.05). In addition, the number of bone marrow nucleated cells, the DNA content in the bone marrow, and GSH content in the liver were significantly increased in the irradiation+high dose group of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract, and the differences were statistically significant (t=3.28, 3.93, 3.07; all P<0.05). Conclusion The Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract has a certain protective effect on radiation injury of the hematopoietic system in mice. -
图 1 黄杞叶提取物对DPPH（A）和ABTS（B）自由基的体外清除能力
Figure 1. Scavenging effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (A) and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (B) free radicals in vitro
图 2 黄杞叶提取物对7.2 Gy（致死剂量）137Cs γ射线照射后小鼠存活率的影响
Figure 2. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on survival rate of mice irradiated with 7.2 Gy (lethal dose) 137Cs γ-rays
图 3 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠体重的影响
Figure 3. Effect of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on body weight of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
图 4 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠脾脏（A）和胸腺（B）的影响
Figure 4. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on spleen (A) and thymus (B) in mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
图 5 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠外周血各项指标的影响
Figure 5. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on various indexes of peripheral blood of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
图 6 黄杞叶提取物对4 Gy 137Cs γ 射线照射后小鼠BMNC数量及骨髓DNA含量的影响
Figure 6. Effects of Engelhardia roxburghiana Wall. leaf extract on the number of bone marrow nucleated cells and DNA content in bone marrow of mice irradiated with 4 Gy 137Cs γ-rays
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