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p16基因是一种抑癌基因，近年来发现它在细胞衰老过程中发挥重要作用。p16是细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent protein kinase，CDK）4和CDK6的抑制物，p16通过与CDK4和CDK6结合，阻滞CDK4、CDK6与cyclinD结合，抑制cyclinD-CDK复合物的活性，阻断对Rb蛋白（一种核磷酸蛋白）的磷酸化，使细胞停滞在G0期，不能进入细胞周期循环而处于静息状态[1-2]。p16在许多细胞进入衰老时均过度表达，其持续表达导致了细胞衰老。目前，p16已成为细胞衰老研究的热门靶点之一。RNA干扰是转录后水平序列特异性的抑制基因表达的一种天然机制。在本研究中我们构建了RNA干扰载体，并将表达载体成功地转染至辐射诱导衰老的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中，观察其对p16的干扰效果，旨在为后续p16相关研究提供实验基础。
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表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR、BLOCK-iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP、脂质体LipofeetamineTM2000和Trizol购自美国Invitrogen公司; DH5α感受态细胞购自德国TIANGEN公司; T4 DNA连接酶购自美国Promega公司; 实时荧光定量PCR试剂盒和ABI Prism 7500 Sequence Detection System购自美国ABI公司; 质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司; Turbo Script逆转录第一链cDNA合成试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司; Radio Immunoprecipitation Assay裂解液购自美国Pierce公司; bicinchoninic acid试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; 兔抗小鼠p16、兔抗小鼠β-actin一抗和山羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司; Senescence β-Galactosidase Staining Kit购自美国Cell Signaling technology公司。MEF细胞由本实验室保存。其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。ChemiDocTM XRS+成像系统购自美国BIO-RAD公司; 137Cs γ射线照射源由加拿大原子能有限公司生产，型号为Autocell40，剂量率0.80 Gy/min; eclipse 90i荧光显微镜购自日本Nikon公司。
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以小鼠p16基因（NM_009877）作为目的基因，应用Invitrogen公司提供的辅助设计软件（Block-iT RNAi Designer）设计siRNA。miRNA-155是目前剪切位点研究较为清楚的天然miRNA[3]，本研究选择miRNA-155作为骨架，结合线性化pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体的特点，选择符合条件的靶位点，设计两段互补的寡核苷酸序列，每对寡核苷酸的核心序列反向互补，并将备选序列和相应的基因数据库进行Blast同源比对，排除与p16基因高度同源的序列。设计好的序列（表 1）由上海英骏生物技术有限公司合成。
引物名称 序列 mp16-1F 5'-TGCTGTTAGCTCTGCTCTTGGGATTGGTTTTGG-CCACTGACTGACCAATCCCAAGCAGAGCTAA-3' mp16-1R 5'-CCTGTTAGCTCTGCTTGGGATTGGTCAGTCAGT-GGCCAAAACCAATCCCAAGAGCAGAGCTAAC-3' mp16-2F 5'-TGCTGAGCTGAAGCTATGCCCGTCGGGTTTTGG-CCACTGACTGACCCGACGGGTAGCTTCAGCT-3' mp16-2R 5'-CCTGAGCTGAAGCTACCCGTCGGGTCAGTCAG-TGGCCAAAACCCGACGGGCATAGCTTCAGCTC-3' Table 1. Sequences of siRNA template oligonucleotides
将2对合成好的oligo用灭菌双蒸水溶解成100 μmol/L双蒸水，互补单链各取5 μl两两混合，加入2 μmol/L 10×退火缓冲液和8 μl灭菌双蒸水，95 ℃加热5 min，然后放置室温自然冷却20 min，形成双链oligo。取1 μl退火产物，继续稀释成10 nmol/L浓度。在无菌离心管中，依次加入4 μl 5×连接缓冲液、9 μl灭菌双蒸水、2 μl pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR质粒、4 μl 10 nmol/L ds oligo、1 μl 1U/μl T4 DNA连接酶，充分混匀后室温连接30 min。取2 μl上述重组体转化DH5α感受态细胞，在含50 μg/ml壮观霉素的Luria-Bertani琼脂板上培养16 h，挑选阳性克隆摇菌过夜。利用试剂盒提取质粒，送上海英骏公司测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。
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将生长状态良好的MEF细胞按照每孔1×105个细胞接种于六孔板中，H-DMEM培养液（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素）在37 ℃、5% CO2培养箱内培养，待细胞生长融合至80%左右，用10.0 Gy 137Cs γ射线照射细胞[4]。照射后，采用脂质体LipofeetamineTM2000进行质粒转染细胞。具体转染操作根据脂质体转染说明书进行。每孔细胞分别加入2 μg质粒和5 μl脂质体，转染4 h更换含10%胎牛血清的无抗生素H-DMEM培养液，继续培养。
实验分组：对照组（不做任何处理）、照射组（接受10.0 Gy 137Cs γ射线照射）、照射+p16 siRNA-1组、照射+p16 siRNA-2组（接受10.0 Gy 137Cs γ射线照射后分别转染p16基因特异性siRNA-1和siRNA-2）、照射+空载组（接受10.0 Gy 137Cs γ射线照射后转染空载对照siRNA）。
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细胞转染后24 h，收集细胞，用Trizol法提取细胞的总RNA。取少量用于RNA含量及纯度测定。总RNA按照Turbo Script逆转录第一链cDNA合成试剂盒进行cDNA第一链的合成。cDNA反转录反应体系为20 μl，反应条件为65 ℃ 5 min，42 ℃ 50 min，70 ℃15 min; 用实时荧光定量探针法检测样品中成熟mRNA分子的水平，实时荧光定量PCR反应体系为25 μl，反应条件为50 ℃2 min，95 ℃10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 s）×40循环。每个样本重复测量3次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达量为参照标准，按照2-ΔΔt计算p16 mRNA相对表达量。
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收集转染后24 h的细胞，用PBS洗涤2遍，细胞总蛋白抽提液提取总蛋白，并采用BCA法检测样品中蛋白的含量。取20 μg混合蛋白上样缓冲液，在100 ℃下加热10 min，采用15%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳后转至聚偏二氟乙烯膜。转膜结束后室温封闭1 h，加入兔抗小鼠p16抗体4 ℃过夜，洗膜后加入相对应的二抗室温孵育1 h，洗膜，最后加化学发光显色试剂，在ChemiDocTM XRS+成像系统中成像。另外，采用抗β-actin多克隆抗体检测β-actin蛋白表达作为样品内参以及转膜的效果。
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细胞转染后5 d，将24孔板中的细胞用PBS洗涤2遍，在室温下用1×定影液固定细胞10~15 min，用PBS洗涤2遍，加入1 ml染色混合液，37 ℃下过夜，具体操作步骤按照SA-β-Gal检测试剂盒说明书进行。衰老细胞染成蓝色为阳性细胞，光镜下观察并拍照，同时计算每200个细胞中阳性细胞的百分率[5]。
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实验结果以均数±标准差（x±s）表示，数据分析采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
1.1. 试剂与仪器
1.2. 载体构建
1.3. 细胞培养、转染及分组
1.4. 实时荧光定量PCR检测RNA干扰后p16基因mRNA表达水平的变化
1.5. Western blot检测RNA干扰后p16基因mRNA表达水平的变化
1.6. 衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase，SA-β-Gal）活性的检测
1.7. 统计学处理
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测序分析证明重组体中插入片段的碱基序列完整，没有碱基的突变以及丢失，表明已成功构建了针对鼠p16基因的p16 siRNA-1和p16 siRNA-2表达质粒。
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pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR质粒带有绿色荧光蛋白基因，转染细胞24 h后，通过荧光显微镜观察绿色荧光，显示辐射诱导衰老MEF细胞在转染后有绿色荧光蛋白表达，说明转染成功（图 1）。
Figure 1. Expression of pcDNATM 6.2-GW/EmGFP miR plasmid after transfecting the mouse embryonic fibroblast cells under the fluorescence microscope(×200)
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由图 2可见，经10 Gy137Cs γ射线照射后24 h，照射组小鼠胚胎成纤维细胞p16的mRNA相对表达水平较对照组升高，两者间的差异有统计学意义（t=87.60，P＜0.05）; 照射+空载组与对照组比较，p16的mRNA相对表达水平升高（t=85.32，P＜0.05）; 辐射诱导衰老的MEF细胞RNA干扰后24 h，与照射组比较，照射+p16 siRNA-1和照射+p16 siRNA-2组p16的mRNA水平显著降低（t=16.52、16.13，P均＜0.05）。
Figure 2. Expression levels of p16 mRNA in mouse embryonic fibroblast cells before and after transfection was measured by real-time PCR
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与照射组比较，照射+p16 siRNA-1和照射+p16 siRNA-2组的p16蛋白表达水平有所降低，而照射+空载组的p16蛋白表达水平与照射组相比则无显著差别（图 3）。
Figure 3. Expression levels of p16 protein in mouse embryonic fibroblast cells after 48 h of transient transfection of the plasmid
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SA-β-Gal染色后衰老细胞呈阳性，胞质内可见蓝色颗粒; 阴性细胞未着色。结果表明，照射组和照射+空载组的SA-β-Gal染色阳性细胞百分比显著高于对照组（t=72.91、72.73，P均＜0.01）; 照射+p16 siRNA-1和照射+p16 siRNA-2组SA-β-Gal染色阳性细胞百分比与对照组（t=35.19、34.92，P均＜0.01）和照射组（t=37.72、38.09，P均＜0.01）比较，差异均有统计学意义（图 4、表 2）。
Figure 4. Representative images of mouse embryonic fibroblast cells senescence associated-β-galactosidase activity in different group
组别 SA-β-Gal阳性细胞百分比（%） 对照组 1.83±0.76 照射组 68.83±1.26 照射+空载组 68.67±1.76 照射+p16 siRNA-1组 34.17±2.08 照射+p16 siRNA-2组 33.83±1.75 注：表中，SA-β-Gal：衰老相关β-半乳糖苷酶。 Table 2. The percentage of mouse embryonic fibroblast cells senescence associated-β-galactosidase positive cells in different group
(n=3, x±s)
2.1. 重组质粒测序结果
2.2. 干扰质粒转染MEF细胞
2.3. p16基因mRNA表达水平的变化
2.4. p16基因蛋白表达水平的变化
2.5. SA-β-Gal活性的变化
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本研究设计并构建了小鼠p16的RNA干扰载体，经测序证实了所构建表达载体的正确性，而后通过脂质体介导的质粒转染，通过观察到目的细胞MEF中绿色荧光蛋白的表达，说明所构建的重组体能够有效地转染到目的细胞。
已有大量研究证实，电离辐射可以引起DNA损伤，最终导致细胞衰老[6-7]。本研究采用我们前期建立的10.0 Gy 137Cs γ射线照射诱导的小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型[4, 8]，经实时荧光定量PCR和Western blot检测表明：2个RNA干扰载体都能使靶基因p16的mRNA和蛋白表达水平降低，而照射+空载组的p16 mRNA和蛋白表达水平与照射组比较则无显著差异，这提示2个siRNA干扰载体在转染目的细胞辐射诱导衰老的MEF细胞后都有干扰p16基因表达的作用。
Dimri等[5]1995年首次提出一种鉴定细胞衰老的标志酶SA-β-Gal，他们的研究发现，衰老成纤维细胞和角质形成细胞均表达此酶，而休眠细胞和终末分化细胞则缺乏。因此，目前将SA-β-Gal染色作为细胞衰老的生物学标志[2]。p16在许多细胞进入衰老时均过度表达，其持续表达导致了细胞衰老。在本研究中，通过脂质体介导的质粒转染组SA-β-Gal染色阳性细胞百分比较照射组明显降低，说明转染后p16表达降低，衰老在一定程度上被抑制。
本研究初步探讨了RNA干扰沉默p16基因表达可以抑制MEF细胞的衰老，为后续相关研究提供了实验基础。
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