Research progress of CXC chemokine receptor type 4 and molecular imaging in tumors

趋化因子是一类对免疫细胞具有化学趋化性的、分泌型的小分子蛋白质超家族，包括一些小分子前炎症因子及其受体，相对分子质量为8000~12 000，根据其4个保守半胱氨酸残基的位置不同而分为4个类型：CXC、CX3C、CC和C ^[1]。趋化因子主要产生于肿瘤细胞和肿瘤间质细胞（包括血管内皮细胞和趋化因子介导浸润的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞等）^[2]。趋化因子通过与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）结合而在一些免疫反应中发挥了调节感染、炎症以及组织修复等作用。经研究证实，现已发现50多种趋化因子和20种趋化因子受体^[3]。

CXC型趋化因子配体12（CXC chemokine receptor ligand 12，CXCL12）又称基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1），是一种由骨髓间质细胞分泌的CXC型趋化因子，主要来源于骨髓、淋巴结、肌肉和肺源性成纤维细胞。人CXCL12分为α、β两种，且前者几乎在所有器官中均有表达^[4]。CXCL12的主要生物学功能是参与组织血管的生成、B淋巴细胞和骨髓组织的生成及胶原蛋白的产生等。它还可以通过与CXCR4的N端结合，从而在介导免疫及炎症反应、调节造血、诱导血管生成及肿瘤的侵袭转移等过程中发挥重要作用。

CXCR4为高度保守的7次跨膜GPCR，可以选择性地在靶细胞表面表达。Feng等^[5]在1996年发现并将其命名为Fusin，后又称其为LESTR或HUMSTR。它由352个氨基酸组成^[6]，编码基因位于2q21染色体^[7]，与G蛋白偶联的为胞内区，C端因含有丝氨酸/苏氨酸故可进行磷酸化，在生物体内主要参与信号转导。根据趋化因子受体与其相应的趋化因子间相互作用的特性不同，而将趋化因子受体分为：CXCR1-6、CCR1-11、XCR1以及CX3CR1等^[8]。CXCR4在多种细胞中均有表达，如CD34⁺肝星状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、小胶质细胞、星形细胞、神经元细胞和祖细胞等^[9]。

一种趋化因子可以与多种受体结合，同样，一种受体亦可与不同的趋化因子结合，但CXCR4有且仅有一个配体，即CXCL12，两者构成偶联分子对，通过激活下游不同的信号通路而发挥不同的生物学功能。CXCR4的活化是通过与细胞质膜内的异源三聚体G蛋白相偶联来介导的，而异源三聚体G蛋白又是由Gα、Gβ和Gγ亚基组成，且GPCR的不同下游信号通路大部分是以Gα为基础而发挥作用的^[10]。Gα又包括Gαs、Gαi、Gαq和Gα12等4个亚基。GPCR与Gαs偶联后可以激活腺苷酸环化酶，而与Gαi偶联则可抑制该酶的活化。腺苷酸环化酶可以催化ATP分解为cAMP，从而进一步激活cAMP依赖的蛋白激酶，这些酶类可以调节包括丝裂原活化蛋白激酶在内的下游信号通路^[11]，如激活蛋白激酶B/丝裂原活化蛋白激酶信号通路，从而导致基因表达的改变、肌动蛋白的聚合、细胞骨架的重排及细胞迁移等^[12]。GPCR与Gαq结合后可以通过磷酸脂酶Cβ催化磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸分解为甘油二脂和三磷酸肌醇，甘油二脂可以激活下游蛋白激酶C，而三磷酸肌醇可以激活内质网的钙通道，促进细胞内钙离子释放到细胞质中^[13]。而Gβγ与GPCR结合后可以激活磷脂酰肌醇激酶3，活化后的磷脂酰肌醇激酶3可以进一步激活黏着斑激酶，后者可以引起包括癌细胞在内的多种细胞的迁移^[14]。CXCR4亦是肿瘤细胞与细胞外蛋白质类（例如层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等）相互作用的重要介质，这些蛋白质类在转移灶的播散方面发挥着重要作用^[15]。根据之前对CXCL12/CXCR4信号转导通路的研究结果，近来越来越多的研究证实CXCL12/CXCR4生物轴在肿瘤增殖、浸润、转移和血管新生等生理过程中发挥着重要作用^[16-22]。

CXCL12/CXCR4生物轴在肿瘤的发生、发展、血管生成和转移等生物学过程中起着很重要的作用。因CXCL12/CXCR4生物轴在乳腺癌的转移过程中发挥了重要作用，故将CXCR4的过度表达认为是用于诊断侵袭性疾病的几种生物标志物（包括人类表皮生长因子受体2）之一^[23]。Mimeault和Batra^[24]提出在肿瘤的原始细胞中存在着多种上调致癌基因表达的信号通路，这些信号通路在癌症的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用，而CXCL12/CXCR4信号通路则是其中之一。有研究证实，肿瘤的器官转移特异性是由于高表达CXCR4的肿瘤细胞在CXCL12的趋化作用下转移至产生这一配体的一些器官，如2001年Müller等^[25]首先报道，CXCR4和CC型趋化因子受体7（C-C chemokine receptor type 7，CCR7）在人乳腺癌细胞系和组织中均高表达，而乳腺癌最常见的转移部位如骨髓、淋巴结、肺和肝脏等则高表达CXCR4的配体CXCL12和CCR7的配体CCL21，且这两种配体主要调节乳腺癌细胞的迁移。

迄今为止已发现至少23种不同类型的肿瘤表达CXCR4，例如乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、黑素瘤及卵巢癌等^[26]，且其表达量与患者的预后密切相关。Yu等^[27]在针对三阴性乳腺癌中CXCR4表达量的研究中发现，CXCR4在该肿瘤中的过度表达可能是提示该肿瘤预后不良的指标。针对前列腺癌细胞系PC3中的CXCR4的研究显示，CXCR4在诱导细胞发生转移、增殖和存活方面发挥着重要作用^[28]。另外亦有多项研究显示，原发部位CXCR4的过度表达与肿瘤局部复发、远处转移和患者较差的远期生存率有直接关系^[2]。

多项体外研究表明，CXCL12/CXCR4生物轴可促进多种肿瘤细胞的增殖^[29]。CXCR4的趋化性是由磷酸肌醇3激酶介导的，后者可以使丝氨酸/苏氨酸激酶活化，已证实这一激酶在肿瘤的存活和增殖中发挥重要作用^[30]。Su等^[31]研究发现，SDF-1可促进高表达CXCR4的肺癌细胞系95D的增殖。有研究显示，CXCL12/CXCR4生物轴对肿瘤细胞的凋亡也起着调节作用。CXCL12/CXCR4生物轴可以活化蛋白激酶B，而蛋白激酶B可以通过磷酸化和促使细胞凋亡机制中一些因子（例如局部黏着板激酶、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9和叉头蛋白1等）失活而发挥促进细胞生存的作用^[32]。

肿瘤的原发灶和转移灶得以生存的必要条件就是丰富的营养供给，而新生血管的形成是这一必要条件的来源。CXCL12/CXCR4生物轴是血管内皮细胞形成新生血管的重要因素。有研究显示，缺乏CXCR4或者CXCL12的小鼠在发育过程中会出现血管生成和心脏室间隔形成障碍^[33]。牛作兴等^[34]通过对胰腺癌的研究证实，CXCR4通过促进新生血管的形成从而在肿瘤的发展、演变的过程中起了重要作用。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是正常组织和肿瘤新生血管形成过程中的重要因子。尽管正常组织也会表达VEGF，但很多研究显示VEGF的高表达与恶性肿瘤微血管的异常增生有着较密切的关系。Hassan等^[35]用CTCE-9908（CXCR4的拮抗剂）对乳腺癌小鼠模型进行治疗，结果发现VEGF的蛋白表达量下降了42%，说明CXCR4可以通过调节VEGF的表达量从而对肿瘤新生血管的形成产生影响。

恶性肿瘤患者的生存率较低主要是因其发生的器官肿瘤选择性转移过程较为复杂且难以控制，有学者提出了CXCL12/CXCR4生物轴参与肿瘤特异性转移的可能机制：肿瘤细胞在原发部位进行增殖，其细胞表面会表达CXCR4；而有些器官表面则高表达其配体CXCL12，借助二者之间特异性结合的能力、肿瘤微环境以及CXCL12/CXCR4生物轴激活细胞表面的黏附分子而导致肿瘤细胞发生局部增殖、血管增生，进而形成转移瘤^[36]。

Müller等^[25]首先发现利用一些物质如特异性多肽等可阻断CXCR4表达，进而可以明显抑制乳腺癌向其好发转移部位（如淋巴结和肺）的侵袭。CXCL12可以引起人类表皮生长因子受体2的反式激活，而CXCR4则可以促进乳腺癌细胞转移至骨组织^[37]。Zhang等^[38]提出CXCR4可以与多种基因（如基质金属蛋白酶1、转化生长因子β等）协同作用，共同促进肿瘤的骨转移。Gassmann等^[39]针对结直肠癌不同的肝转移的细胞系进行活体内研究，结果发现CXCR4 mRNA低表达的细胞系（Caco-2和HT-29P）其发生转移的可能性也较低。另有研究显示，共表达CXCR4和CCR7的胃癌细胞系其发生淋巴结转移的可能性也较高^[40]。有研究指出，CXCR4的高表达与乳腺癌和口腔的鳞状细胞癌的淋巴结转移密切相关^[41]。综上所述，CXCL12/CXCR4生物轴在肿瘤转移的过程中发挥了至关重要的作用。

因CXCL12/CXCR4生物轴在恶性肿瘤的侵袭和转移过程中起着非常重要的作用，所以，各种可能抑制CXCL12/CXCR4生物轴的方法均有可能成为肿瘤靶向治疗的新途径。目前主要的治疗方法有应用CXCR4的拮抗剂、CXCR4的单克隆抗体、RNA干扰抑制肿瘤细胞CXCR4的表达等，而有关CXCL12或CXCR4拮抗剂的研究仍处于临床前实验阶段。CXCR4的拮抗剂主要分两类：一类是鲎抗菌肽（polyphemusin）Ⅱ衍生物，其合成衍生物包括T140、T14003、TC140012、T22和T134等；而另一类是双环拉胺类（bicyclam），包括ADM3100、CGP6422、ALX40-4C等^[42]。

Takaoka等^[43]使用一氧化氮合酶抑制剂和CXCR4拮抗剂作用于皮下种植口腔腺样囊性癌的裸鼠模型，结果显示联合应用一氧化氮合酶抑制剂和CXCR4拮抗剂可以有效诱导癌细胞凋亡及抑制肿瘤新生血管的形成，且还可抑制该肿瘤肺转移的发生。在急性早幼粒细胞白血病的小鼠模型中，与未经处理和仅用阿糖胞苷治疗的小鼠比较，使用CXCR4拮抗剂治疗会增加白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性及延长荷瘤小鼠的存活期^[44]。Burger和Peled^[45]应用CXCR4的小分子抑制剂如plerixafor或BKT140，针对CXCR4或CXCL12的封闭抗体在多种肿瘤中进行了试验，同样也获得了较理想的效果。Kioi等^[46]联合应用放射疗法和CXCR4拮抗剂AMD3100治疗胶质母细胞瘤的小鼠模型，研究显示在随访观察的100 d以内，血管生成及肿瘤的复发明显减少。师佳佳等^[47]研究雷帕毒素对骨髓瘤细胞系RPMI8226体外增殖、凋亡、细胞周期及对CXCR4表达的影响，应用RT-PCR技术检测雷帕毒素作用前后RPMI8226细胞CXCR4 mRNA的表达水平，结果发现CXCR4 mRNA的表达呈剂量依赖性下调。更有临床试验证明，非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤的患者联合应用plerixafor和粒细胞集落刺激因子治疗的效果较单独使用后者的效果好很多^[48]。

除了以上提到的拮抗剂外，RNA干扰技术在抑制CXCR4的表达方面也被广泛地研究。RNA干扰技术是利用特异性双链小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）激活RNA酶，进而降解靶基因的技术，是一种转录后沉默基因的方法。Wang等^[49]利用RNA干扰技术对高表达CXCR4的肾癌细胞系（A-498）进行基因沉默，通过RT-PCR、Western blot、MTT和Transwell小室等检测技术证实，CXCR4的表达可被显著抑制，进而导致肿瘤细胞的生长和转移也受到抑制。Chen等^[50]采用针对CXCR4的双链siRNA转染人卵巢癌细胞系SW626，并通过RT-PCR、Western blot检测转染后的CXCR4 mRNA和蛋白的表达量，通过MTT观察细胞的增殖情况，采用细胞侵袭小室分析细胞的侵袭和转移情况，结果发现CXCR4 siRNA可以有效降低CXCR4的表达，从而降低SW626细胞的增殖、侵袭和转移能力。上述实验结果均显示，CXCR4有望成为治疗肿瘤的一个新靶点。

如前所述，CXCL12/CXCR4生物轴与肿瘤的生长、发展及转移过程密切相关，关于CXCL12/CXCR4生物轴作用机制的探索引起越来越多研究者的关注。为了证实这一理论模型，研究人员采取多种实验方法力求得出佐证这一理论模型的实验结果。随着各种影像学成像技术发展的日渐成熟，人们不再局限于进行统计学的数据论证，而将更多的注意力放在了CXCR4的分子显像方面，如免疫荧光显像、SPECT/CT及PET显像等。各种以CXCR4为靶点的显像剂也越来越多地应用于临床前的实验研究中，这些显像剂主要包括基于分子肽的拮抗剂（如T22、T140）和一些小分子拮抗剂（如杂环烷烃类），它们能够与CXCR4结合的主要原理是CXCR4在细胞表面主要带负电荷，而以上这些显像剂则带较多的正电荷，通过正、负电荷间相互作用的原理达到这些显像剂与CXCR4相结合的目的^[28]。

小分子拮抗剂如双环胺类的AMD3100是第一个用于临床试验的非肽类的CXCR4抑制剂，它现在主要应用于干细胞的动员^[51]。环胺类显像剂可以与过渡金属如铜、锌等形成稳固的络合物，从而使得AMD3100类似物的放射性标记和CXCR4表达的显像具备了可行性。Jacobson等^[52]使用⁶⁴Cu对AMD3100进行了放射性标记，而后对具有免疫能力的小鼠进行注射，结果显示在小鼠肝脏和淋巴器官中检测到的放射活性最高。与Jacobson等的研究相似的是，Nimmagadda等^[53]在皮下种植脑胶质瘤U87细胞系的小鼠的⁶⁴Cu-AMD3100显像过程中也发现了肝脏和淋巴组织对于放射性物质的摄取较多。这种放射性分布规律在Nimmagadda等之后的一些实验研究及其他研究小组的实验中亦得到证实^[53-54]。之后，Nimmagadda等^[53]又应用CXCR4的特异性拮抗剂AMD3100与Cu形成络合物，利用PET对乳腺癌的肺转移瘤进行了显像，该研究证实在肺部的转移灶中的确可见到因CXCR4表达量的增加而引起的放射性浓聚。然而，较低的亲和力限制了这一显像剂的应用。而基于CXCR4的第二代单环胺类抑制剂AMD3465则具备了较高的亲和力、较少的电荷及较小的体积等优点^[55]。De Silva等^[55]的研究显示⁶⁴Cu-AMD3465用于PET显像具有较高的靶向特异性。

单克隆抗体亦作为放射性标记显像剂而引起了人们越来越多的关注。Nimmagadda等^[56]应用¹²⁵I标记了CXCR4的单克隆抗体12G5，并用其在胶质瘤的小鼠模型上进行了显像，显像后的数据显示¹²⁵I-12G5在肿瘤部位有特异性浓聚，尽管在脾中亦发现了较高的放射性浓聚，但这些结果仍然确立了使用放射性标记的单克隆抗体对CXCR4进行显像的可行性。鲎肽为之后的基于肽类的CXCR4显像剂奠定了基础。研究显示，T140结构中的精氨酸、L-3-（2-萘基）-丙氨酸、酪氨酸在与CXCR4结合的过程中发挥了重要作用^[57]。在T140这一类肽中第一个应用于显像的是Ac-TZ14011，用¹¹¹In进行放射性标记，以DTPA作为¹¹¹In与此肽之间的螯合剂，结果显示，尽管肿瘤的摄取较肌肉或血液高，但在肝脏、肾脏和脾中的放射性浓聚则较肿瘤组织高出15~200倍^[58]。另一类T140酰化后的类似物TN14003则以¹⁸F进行了放射性标记，并用于卵巢癌的小鼠模型的CXCR4显像，结果显示，CXCR4表达阳性的肿瘤与对照组的肿瘤可以通过显像后的图像进行辨别^[59]。George等^[60]在体外合成了一种CXCR4拮抗肽TN14003的新型衍生物CCIC16，并成功用⁶⁸Ga进行了放射性标记，研究证实⁶⁸Ga-CCIC16可以作为表达CXCR4的肿瘤细胞的PET显像剂。因肿瘤细胞表面受体密度较低，以上这些以受体为靶点的显像剂的靶向特异性较低成为其在临床中应用时的较大缺点^[53]。与此相似的，用⁹⁹Tc^m或近红外荧光标记的CXCL12的体内成像效果较差，从而限制了其应用^[61-62]。

以上所提到的这些显像剂包括低分子量显像剂均在肝脏有较高的摄取，故会对肝脏造成显像损伤，从而限制了这些显像剂的应用。但是，最近有新的研究发现，⁶⁸Ga-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸-共轭肽具有较高的全身对比度、较低的肝脏摄取和较快的肾脏清除率，这一研究成果有望解决以受体为靶点的显像剂的应用局限性问题^[63]。Zhang等^[64]以¹⁸F标记氟丙酸乙酯与CXCR4的拮抗肽TC14012相偶联，并将合成的¹⁸F-FP-Ac-TC14012用于CXCR4 PET显像，结果图像显示出较高的肿瘤摄取和较好的肿瘤与本底的对比度。Hartimath等^[65]则用[⁹⁹Tc^m]O₂-AMD3100作为CXCR4的microSPECT的显像剂，结果显示该显像剂可以与高表达CXCR4的器官及肿瘤特异性地结合。基于RNA干扰技术，也可以从CXCR4的双链siRNA或反义寡核苷酸的标记入手，研究可以标记CXCR4反义寡核苷酸或者双链siRNA的方法，这样既可以对其进行显像，也可以抑制该趋化因子受体基因的表达，从而达到治疗和显像的双重目的。

综上所述，CXCL12/CXCR4生物轴在肿瘤的生物学行为中所发挥的作用被越来越多的研究所证实，无创性的分子显像将为CXCL12/CXCR4生物轴在不同肿瘤中的表达规律、早期浸润或转移的诊断提供新的依据，并且针对该趋化因子受体的显像也将对肿瘤治疗后的疗效评价起到预示性的作用。因此，今后CXCR4分子显像的结果将成为辨别高表达CXCR4肿瘤的恶性程度、判定肿瘤发生远处转移的部位以及评价肿瘤治疗疗效等方面的又一有力依据。