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DNA双链断裂（double-strand break，DSB）是射线等外源性因素致DNA损伤中最严重的一种类型，机体为维护基因组的完整性，可启动两种不同的途径对DSB进行修复[1]：非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）途径和同源重组（homologous recombination，HR）途径。虽然两者在修复DSB中均发挥着重要作用，但也存在着竞争和协同作用[2]。Ku70（一种NHEJ蛋白）和Rad51（一种HR修复蛋白）分别是NHEJ和HR中的重要组成蛋白。本研究以Ku70为靶点，通过调控Ku70蛋白表达水平来观察其对Rad51蛋白表达的影响，以期为研究NHEJ与HR的相互作用提供帮助。
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人胃腺癌细胞系SGC7901和人食管癌细胞系EC109为本实验室保存，人非小细胞肺癌细胞系H460由中国医学科学院生物技术研究所白利平博士惠赠，以上3种细胞系均采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（美国Gibco公司）在37 ℃、5% CO2条件下常规培养。真核细胞Ku70表达质粒PGCsi3.0-hKu70由本实验室构建，采用LipofectamineTM 2000转染试剂（美国invitrogen公司）进行肿瘤细胞瞬时转染。
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肿瘤细胞均置于137Cs γ源（加拿大原子能有限公司）下照射，源靶距为30 cm，剂量率为0.793 Gy/min，照射吸收剂量为4 Gy。照射后细胞继续培养。
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为观察Ku70蛋白对Rad51蛋白表达水平的影响，实验分为4组，分别为空白对照组、单纯照射组（经4 Gy γ射线照射后48 h的细胞）、靶向Ku70基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）单纯转染组（靶向Ku70基因siRNA转染48 h后的细胞）、靶向Ku70基因siRNA转染联合照射组（先经靶向Ku70基因siRNA预处理48 h，再经4 Gy γ射线照射后48 h的细胞）。
为证实Ku70蛋白对Rad51蛋白的调控作用，按照PGCsi3.0-hKu70分别瞬时转染EC109、H460和SGC7901 3种肿瘤细胞后持续时间的不同，分为转染后6 h组、48 h组、72 h组和空白对照组。
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当细胞生长至亚融合状态时收集细胞，用细胞裂解液（美国Pierce公司）裂解细胞。蛋白定量操作按二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒（日本Takara公司）说明书进行。取50 μg蛋白进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的tris-buffered saline and tween 20（TBST）缓冲液中4 ℃封闭过夜，加入一抗Anti-Ku70（英国abcam公司，1:1000稀释）、Anti-Rad51（美国sant cruz公司，1:1000稀释），室温下孵育2 h，洗膜，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（武汉博士德生物工程有限公司，1:3000稀释），室温下孵育1 h，采用电致化学发光法检测蛋白表达情况。以β-actin作为内参蛋白。采用Quantity One软件分析条带灰度值。
1.1. 细胞系和质粒
1.2. 细胞照射条件
1.3. 实验分组
1.4. Western blot实验
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靶向Ku70基因siRNA对肿瘤细胞Rad51蛋白表达水平的影响结果见图 1，SGC7901、EC109和H460 3种肿瘤细胞经γ射线照射后Rad51蛋白表达水平均较空白对照组明显升高；靶向Ku70基因siRNA单纯转染组Rad51蛋白表达水平较空白对照组明显下降；靶向Ku70基因siRNA转染联合照射组肿瘤细胞的Rad51蛋白表达水平较靶向Ku70基因siRNA单纯转染组没有升高。
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Ku70蛋白高表达对Rad51蛋白表达水平的影响结果见图 2，随着PGCsi3.0-hKu70质粒转染后时间的延长，Ku70蛋白的表达水平也逐渐升高，而Rad51蛋白表达水平也随之升高，且3种细胞系均表现相同。
2.1. 靶向Ku70基因siRNA对肿瘤细胞Rad51蛋白表达水平的影响
2.2. Ku70蛋白高表达对Rad51蛋白表达水平的影响
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DSB修复与放射敏感性密切相关，抑制DSB修复是肿瘤放疗增敏的主要手段之一。因此，明确HR与NHEJ 2种修复方式间的相互作用，对于靶向增强肿瘤的放射敏感性具有一定的指导作用。
HR与NHEJ间既存在着相互竞争，也存在着相互协同作用。这种协同作用最突出的表现就是二者在胚胎脑发育中的作用，Orii等[3]的研究表明，干扰HR将促进增殖早期神经细胞的凋亡，而干扰NHEJ则导致有丝分裂后期细胞凋亡的增加；对HR和NHEJ双突变分析的结果显示，分属HR和NHEJ 2种蛋白（Rad54和Ku80[4]、Rad54和ligase Ⅳ[5]）双缺失所引起表象的改变程度要远远大于其中一种蛋白的单缺失。以上研究表明，HR和NHEJ在DSB修复中发挥着协同作用。但具体的协同作用机制目前尚不明确。
在真核细胞中，NHEJ首先由Ku70/Ku80异二聚体结合到断裂处，然后招募其他蛋白完成断裂处的连接。在HR过程中，必须由Rad51蛋白结合到产生的单链上才能寻找到配对的同源序列完成修复。因此，Rad51和Ku70蛋白分别是HR和NHEJ的重要蛋白。本研究以Ku70和Rad51蛋白为靶点，研究了NHEJ对HR的调控作用，结果表明，靶向Ku70基因siRNA可抑制Rad51蛋白的表达，并对辐射诱导的Rad51蛋白表达水平的升高也具有抑制作用。Ku70对Rad51具有正调控作用。但本研究也存在一定的局限性，因为Rad51蛋白的表达是受细胞周期调控的[6-7]，因此，笔者的后期研究将观察在不同细胞周期中Ku70对Rad51的调节作用，以期进一步明确两者间的相互作用。
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