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放疗、手术和化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段。放疗主要通过各种类型的高能量射线对癌细胞的遗传物质进行破坏，从而起到杀死肿瘤的作用。然而，射线在穿射肿瘤的同时也会对肿瘤周围的正常组织造成损伤，严重影响患者的生活质量[1-3]。因此，在保证放疗疗效的同时减少不良反应是临床放疗追求的目标。为此，近年来，研究人员一直在寻找最佳的放疗方法及剂量分割模式。立体定向放疗的应用[4]，无均整器旋转调强放疗技术的普及[5]，质子、重离子等不同射线源加速器的开发和应用[6]都在一定程度上降低了放疗导致的不良反应的发生率。近几年兴起的超高剂量率（ultra-high dose rate ，UHDR或FLASH）放疗受到了广泛关注。FLASH放疗利用超高剂量率照射（≥40 Gy/s）进行超快速放疗，其剂量率比常规放疗的剂量率高3~4个数量级，照射时间通常≤500 ms[7-9]。
1959年，Dewey和Boag[10]研究结果显示，相较于普通剂量率的照射，细菌受到短时间大脉冲电子照射时的放射敏感性会降低。1967年，Town[11]发现，哺乳动物细胞受到大剂量单脉冲照射后的放射敏感性大大降低。1969年，Berry等[12]也发现，较低剂量率的照射比纳秒级的单脉冲照射对Hela细胞和中国仓鼠细胞增殖能力的抑制效果更明显。20世纪70年代，虽然研究人员对超高剂量率效应的研究取得了一些成果，但未能将其转化到临床应用中[13-16]，其原因可能包括：当时研究人员仅在轻度缺氧的细胞中发现体外诱导的辐射抵抗，提示肿瘤细胞也可能产生类似的抵抗效应，从而影响治疗效果；另外瞬时超高剂量率在技术上难以实现。2014年，Favaudon等[17]重新提出超高剂量率照射可在不影响肿瘤治疗效果的情况下减少放疗的并发症，并正式将这种超高剂量率放疗命名为FLASH放疗。近年来，FLASH放疗的研究越来越多。2023年，Valdés Zayas 等[18]为了验证不同研究中心研究结果的严谨性和可重复性，分析了美国MD安德森癌症中心和瑞士洛桑大学使用FLASH Mobetron系统对小鼠进行全腹部照射后产生的急性反应的数据，结果表明，不同研究中心使用相同参数进行照射可以得到稳定且可重复的FLASH放疗效应。
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目前，FLASH放疗研究的热点主要集中在其可减轻对正常组织的损伤以及与此相关的生物因素方面。FLASH放疗对正常组织保护效应的相关研究见表1。
第一作者[文献序号] 模型（照射细胞或组织） 检测项目 放疗剂量（Gy） 平均剂量率或脉冲内
剂量率（Gy/s）辐射源 Favaudon等[17] 小鼠（胸部） 肺纤维化，TGF-β信号转导，细胞凋亡 17 40~60 电子 Valdés Zayas等[18] 小鼠（腹部） 肠隐窝再生能力 11~14 118~225 电子 Pierre等[19] 小鼠（全脑） 记忆力测试，脑组织损伤 10 >100 电子 Pierre等[20] 小鼠（全脑） 神经认知测试，海马细胞分裂，星形胶质增生 10 37 X射线 Pierre等[21] 斑马鱼（胚胎） 体长 8 >100 电子 小鼠（全脑） 神经认知测试，神经炎症，神经元形态 10 >100 电子 Pierre等[22] 小鼠（全脑） 星形胶质细胞增生 10 5.6×106 电子 Pierre等[23] 小鼠原位胶质母细胞瘤（全脑） 神经认知测试 10、14、4次×3.5、2次×7、3次×10、25 5.6×106、7.8×106、1.9×106、3.9×106、5.6×106、2.5×103 电子 Simmons等[24] 小鼠（全脑） 神经认知测试，树突棘密度，小胶质细胞活化，炎症 30 200、300 电子 Alaghband等[25] 小鼠（全脑） 神经认知测试， 成熟和（或）未成熟神经元的数量， 生长激素水平 8 4.4×106 电子 Iturri等[26] 大鼠原位胶质瘤（全脑） 记忆力测试 25 257±2 质子 Diffenderfer等[27] 小鼠（腹部） 肠纤维化 18 78±9 质子 Levy等[28] 小鼠（腹部） 肠道功能，肠隐窝再生能力 12、14、16 216 电子 Zhang等[29] 小鼠（腹部） 胃肠道损伤 13~22 120 质子 Soto等[30] 小鼠 （胸部） 皮肤损伤 10、16、20、30、40 180 电子 Cunningham等[31] 小鼠（腿部） 软组织损伤，皮肤损伤 35 60 质子 Vozenin等[32] 小型猪（皮肤） 皮肤损伤 22~34 300 电子 Velalopoulou等[33] 小鼠纤维肉瘤（右腿） 皮肤反应，淋巴水肿 30、45 69~124 质子 Buonanno等[34] 人肺成纤维细胞 （IMR90） 克隆细胞存活，TGF-β的表达 0~20 1 000 质子 注：TGF-β为转化生长因子β Table 1. Researches on the protective effects of ultra-high dose rate radiotherapy on normal tissues
Favaudon等[17]从肺部组织形态学、肺部血管和支气管3个方面观察FLASH放疗对肺部造成的损伤，结果显示：17 Gy常规放疗组小鼠最早在治疗后第8周出现肺纤维化，并逐渐恶化，在第24周时形成肺实质的密集纤维化；17 Gy FLASH放疗组小鼠未出现肺纤维化的组织形态学特征和转化生长因子β/SMAD 4的级联反应；而且在FLASH放疗剂量递增（16~30 Gy） 的研究中，行20 Gy FLASH放疗的小鼠仍然没有出现肺纤维化；在肺部血管和支气管损伤的研究中，7.5 Gy常规放疗即可使细胞核中的caspase-3大量裂解，而在17 Gy FLASH放疗组小鼠中未观察到细胞凋亡。由此可见，FLASH放疗可以降低和减轻正常组织早期和晚期并发症的发生率和严重程度。
研究人员进行了一系列FLASH放疗对大脑认知影响的研究，结果显示，与采用常规剂量率的放疗相比，行FLASH放疗的小鼠未出现放疗诱导的学习和记忆功能障碍，且未出现颅内反应性胶质增生[19-23]。2019年，Simmons等[24]进一步研究发现，小鼠行FLASH全脑放疗后，海马树突棘缺失减少，且神经炎症减少。Alaghband 等[25]对行常规放疗和FLASH放疗的幼年小鼠进行神经认知测试，结果表明，与常规放疗相比，FLASH放疗对幼年小鼠的神经系统具有明显的保护效应，为FLASH放疗能够减轻大脑认知障碍提供了证据。他们还发现FLASH放疗可以保护垂体功能，减轻辐射对内分泌系统产生的损伤。除上述对FLASH放疗和常规放疗的电子束进行的研究，2023年，Iturri等[26]对FLASH放疗和常规放疗进行了质子束的研究，他们采用的FLASH放疗的剂量率为（257±2） Gy/s，常规放疗的剂量率为（4±0.02） Gy/s，均以单次大剂量（25 Gy）对大鼠进行颅脑照射，结果表明，大剂量FLASH质子射束照射也可对神经系统起到保护作用。一项对胶质母细胞瘤进行放疗的研究结果表明，低分割多次FLASH放疗对小鼠脑组织同样具有保护效应[23]。
有研究结果显示，FLASH放疗对胃肠道也具有保护效应[18,27-28]。Diffenderfer等[27]以（78±9） Gy/s的剂量率对植入胰腺肿瘤的同基因小鼠分别行常规放疗和FLASH质子放疗，结果表明，与剂量率为（0.9±0.08） Gy/s的常规放疗相比，FLASH质子放疗导致的急性和晚期肠道不良反应极少。但Venkatesulu 等[35]分别对小鼠行腹腔单次16 Gy FLASH放疗（剂量率为35 Gy/s）和常规放疗（剂量率为0.1 Gy/s），发现FLASH放疗比常规放疗更容易诱发急性胃肠道综合征。 Smyth等[36]的研究结果也显示，剂量率为37~41 Gy/s的同步加速器宽束放疗（SBBR）对小鼠的正常组织没有保护作用，这提示FLASH放疗对正常组织保护效应的触发需要一定的剂量阈值。Zhou 等[37]通过量纲分析估计触发超短辐射脉冲 FLASH放疗保护效应所需的每脉冲最小剂量及最小剂量率的数量级，结果表明，触发FLASH放疗保护效应的最小剂量为每脉冲3 Gy，最小剂量率可能为57 Gy/s，其非常接近临床实验中剂量率>40 Gy/s的结论。Zhang等[29]建立了双散射系统用于研究FLASH质子放疗对小鼠不同组织和器官的保护效应，其初步研究结果表明，剂量率>120 Gy/s时，FLASH放疗才能对腹部组织产生保护效应。FLASH放疗没有产生保护效应的原因可能与相关研究中放疗的剂量率偏低有关，低剂量率不足以触发FLASH放疗的保护效应，因此对于诱发FLASH放疗保护效应的条件还需要进行更多的研究。Zhang等[38]使用>100 Gy/s的剂量率对C57BL/6j和Rag1-/-/C57品系小鼠（基因敲除小鼠缺乏成熟的T细胞和B细胞）进行腹部部分照射，但并未触发FLASH的保护效应，反而使2种品系小鼠的死亡数量增加，这提示物理、化学和生物等相关因素可能独立或共同影响FLASH保护效应的激发。
FLASH放疗对小鼠皮肤和软组织也具有很强的保护作用[30-33, 39]。除此之外， Cunningham等[31]发现，FLASH质子照射还可减少小鼠腿部挛缩的发生。
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在肿瘤细胞的体外实验方面，Pierre等[21]使用FLASH（≥100 Gy/s）和常规剂量率（0.07~0.1 Gy/s）分别对小鼠胶质母细胞瘤H454细胞系进行10 Gy照射，结果表明，使用两种剂量率照射的细胞的存活率的差异无统计学意义。当照射剂量提高至20 Gy时，FLASH照射可以显著降低DNA损伤的程度，提高细胞的存活率[34]。而免疫标记的转化生长因子β1和衰老标志物的测定结果也表明，照射剂量>20 Gy时，FLASH照射组较常规剂量率照射组诱导的炎症反应显著减轻。FLASH放疗可减少辐射引起的长期效应的发生，如衰老等[21,34]。Adrian等[40]发现，与常规放疗相比，7种细胞系（人乳腺癌细胞系MCF7 和 MDA-MB-231、人胚肺细胞系 MRC-5 、人宫颈癌细胞系 HeLa早期传代细胞和HeLa高传代亚克隆细胞、人结肠癌细胞系 WiDr、鳞状细胞癌细胞系LU-HNSCC4）中有4种细胞系（人乳腺癌细胞系MCF7 和 MDA-MB-231、人宫颈癌细胞系 HeLa早期传代细胞和HeLa高传代亚克隆细胞、鳞状细胞癌细胞系LU-HNSCC4）在体外常氧条件下存在FLASH效应，并且细胞系之间的FLASH效应不同。
在动物体内实验方面，Favaudon等[17]建立了人乳腺癌HBCx-12A和头颈癌Hep-2的小鼠模型，结果证实FLASH放疗和常规放疗均可有效控制肿瘤。 随后，他们对同基因C57BL/6J小鼠原位移植肺肿瘤的肿瘤生长曲线进行分析，结果表明，15 Gy FLASH放疗组和15 Gy 常规放疗组的治疗效果相当，且剂量增加到23~28 Gy后FLASH放疗组的治疗效果更好，不良反应更少。Vozenin等[32]对6只患有鳞状上皮细胞癌的猫行FLASH放疗和常规放疗，结果表明，行FLASH放疗的猫没有出现急性不良反应，其中5只猫的无进展生存期达到16个月，证实了FLASH放疗具有潜在的优势。一项FLASH放疗治疗人急性T型淋巴细胞白血病（T-ALL）的研究结果也证实了FLASH放疗具有潜在优势[41]。在胰腺癌和卵巢癌模型小鼠中，FLASH放疗与常规放疗对肿瘤的抑制作用的差异无统计学意义[27-28]。Pierre等[23]进一步采用更为接近临床治疗模式的分次FLASH放疗和常规放疗治疗小鼠原位胶质母细胞瘤，结果同样证实FLASH放疗与常规放疗对肿瘤的控制率的差异无统计学意义。值得一提的是，Shi等[42]发现，当FLASH放疗与免疫检查点抑制剂联合使用时，其抗肿瘤免疫反应的效果与常规放疗一致，为FLASH放疗联合免疫治疗的开展提供了理论依据。
在人体临床试验方面，2019年，瑞士洛桑大学医院的Bourhis等[43]为1例经过多次治疗的75岁皮肤淋巴瘤患者实施了FLASH放疗，这也是全球首例接受人体FLASH放疗的病例。患者接受放疗的部位为1个长径为3.5 cm的肿瘤溃疡病灶，放疗总剂量为 15 Gy，共10个脉冲，每个脉冲带宽1 μs，治疗剂量率>106 Gy/s。研究结果表明，行FLASH放疗10 d后患者的肿瘤开始缩小，36 d后有溃疡的肿瘤消失。FLASH放疗过程中仅有照射部位的皮肤毛囊减少、上皮层增厚和皮肤皱褶增多等轻微不良反应，提示FLASH放疗具有理想的疗效。
2023年，辛辛那提儿童医院/辛辛那提大学医学中心质子治疗中心宣布， FLASH质子放疗首个人体临床试验项目——FAST-01取得临床试验成果。FAST-01临床试验对10例肿瘤患者（年龄27~81岁）的12个四肢骨转移病灶行姑息性FLASH放疗，结果表明，其中8个病灶（67%）的疼痛症状得到了缓解，6个病灶（50%）的疼痛症状实现了完全缓解（无疼痛），其疗效和不良事件的发生情况与常规放疗一致[44]。目前，FAST-02临床试验也已开展，该临床试验主要评估FLASH放疗对正常组织的损伤，以及FLASH放疗在治疗胸骨转移中的应用。FLASH放疗在抑制肿瘤生长方面与常规放疗同样有效。FLASH放疗对肿瘤治疗效果的相关研究见表2。
第一作者[文献序号] 模型（照射细胞
或组织）肿瘤类型 检测项目 放疗剂量（Gy） 平均剂量率或脉冲
内剂量率（Gy/s）辐射源 Favaudon等[17] 小鼠（腿部） 人乳腺癌 HBCx-12A 细胞和头颈癌 Hep-2 细胞的异种移植瘤 肿瘤生长 17~25 60 电子 小鼠（胸部） 原位移植肺癌TC-1细胞 肿瘤生长 15~28 60 电子 Pierre 等[23] 小鼠（全脑） 原位胶质母细胞瘤 肿瘤生长 10、14、4次×3.5、2次×7、3次×10、25 5.6×106、7.8×106、
1.9×106、3.9×106、
5.6×106、2.5×103电子 Diffenderfer等[27] 小鼠（腹部） 胰腺肿瘤 肿瘤生长 12、15 78±9 质子 Levy等[28] 小鼠（腹部） 卵巢癌细胞 肿瘤生长 12、14、16 216 电子 Cunningham等[31] 小鼠（腿部） 小鼠口腔鳞状细胞癌细胞（MOC1和MOC2细胞） 肿瘤生长 15 60 质子 Vozenin等[32] 猫（鼻部） 鼻扁鳞状细胞癌 肿瘤生长 25~41 130~390 电子 Velalopoulou等[33] 小鼠（皮肤） 小鼠肉瘤细胞 肿瘤生长 30、45 69~124 质子 Adrian等[40] 细胞系 人乳腺癌细胞系MCF7和 MDA-MB-231，人宫颈癌细胞系HeLa，人结肠癌细胞系WiDr，鳞状细胞癌细胞系LU-HNSCC4，人胚肺细胞系MRC-5 肿瘤细胞存活率 0~12 >800 电子 Shi等[42] 人类（胸部） CD30＋皮肤T细胞淋巴瘤 肿瘤消退 15 167 电子 Mascia等[44] 人类（四肢） 骨转移瘤 癌痛的缓解 8 >40 质子 Rama等[45] 小鼠（胸部） Lewis肺癌 肿瘤生长 18 40 质子 Table 2. Researches on the therapeutic effects of ultra-high dose rate radiotherapy on tumor tissues
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研究人员从放射生物学角度出发，基于FLASH放疗和常规放疗对正常组织影响的差异提出了氧耗竭学说。氧耗竭学说认为FLASH放疗的超高剂量率可能会导致受照射组织发生放射性氧耗竭，出现急性的缺氧期，并因此产生短暂的辐射抗性[8,36,46]。具体来说，就是射线粒子与DNA分子周围其他的化学物质 （主要是水分子）发生作用，产生大量高反应活性的羟基自由基，羟基自由基结合DNA引起的损伤很容易被修复。但在富氧环境中，羟基自由基会与氧分子反应生成氢过氧自由基，氢过氧自由基可能会对DNA造成永久性的损伤[47]。在FLASH放疗中，局部组织在极短的时间内接受大剂量辐射，人体内的水分解产生羟基，导致氧分子耗尽，而新的氧还来不及补充，因此产生了缺氧窗口期，并因此产生瞬态辐射电阻。这种现象在常规放疗中不会出现，因为常规放疗采用的是比FLASH放疗小得多的脉冲和更长的照射时间。因此，常规放疗消耗的氧气有限，而且有足够长的时间让氧气扩散到被照射区域，以补充已消耗的氧气。
氧耗竭学说解释了FLASH放疗对正常组织具有保护效应的原因，但其很难解释为何FLASH放疗与常规放疗有相同的肿瘤治疗效果。虽然与正常组织相比肿瘤组织相对缺氧，但大多数肿瘤组织并不完全缺氧[48]。行FLASH放疗后，由于肿瘤组织也会发生放射性氧耗竭反应，因此推测肿瘤组织也会产生辐射抗性。但目前的研究结果似乎并没有显示肿瘤产生了辐射抗性。
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与常规放疗相比，FLASH放疗激活的免疫应答方式也被认为是其具有正常组织保护效应的潜在机制[7,48]。常规放疗常采用分次照射，与一次完成所有剂量的照射模式相比，其会导致更大比例的外周血淋巴细胞被照射[49]。如典型的 60 Gy 脑部放疗计划（2 Gy ×30次）会导致98.8%的循环血液受到剂量＞0.5 Gy的照射。有文献报道，被射线照射的血池总体积可以决定循环血池中染色体畸变的情况，即辐射损伤情况[50]。由于FLASH放疗的照射时间极短，因此它只能导致很少的淋巴细胞被照射，并减少随后的染色体畸变的发生[8,49]。尽管被照射的淋巴细胞的数量较少，但FLASH放疗会使淋巴细胞受照的剂量增加。假如上述这种独特的免疫应答机制有助于FLASH放疗保护效应作用的发挥，那么分次模式的FLASH放疗可能在一定程度上影响这种保护效应。
一项关于FLASH放疗和常规放疗后小鼠全基因组微阵列分析的对比研究进一步证实了免疫学说[51]。上述研究结果表明，相较于常规放疗，行FLASH放疗的小鼠的免疫系统的广泛激活和免疫细胞的成熟受到抑制。另有研究结果表明，FLASH放疗后肿瘤微环境中T淋巴细胞的聚集情况有所改善[45]。在FLASH放疗与常规放疗对被植入肿瘤细胞的免疫功能低下的动物治疗效果的对比研究中，2种放疗方法治疗肿瘤的效果的差异无统计学意义[23]。然而，虽然免疫作用与FLASH放疗保护效应相互关联，但并不存在因果关系；目前尚不清楚在FLASH照射后的差异性免疫反应是否有利于FLASH放疗产生保护效应。此外，在缺乏免疫功能的细菌和细胞培养模型中可以观察到FLASH放疗保护效应，这说明任何免疫机制都可能是FLASH放疗保护效应底层机制的一部分。今后还需要进行更多的研究以明确FLASH放疗和常规放疗保护效应的差别是否是因为免疫反应或其他生物反应（如DNA损伤反应或炎症反应）的不同造成的，且它们是否只是FLASH放疗保护效应潜在机制的一部分。
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有研究人员提出，FLASH放疗的保护效应还可以通过限制活性氧的产生来实现[21]。目前已有的初步证据表明，常规放疗引起的部分正常组织损伤是由活性氧增加导致的，而FLASH放疗后活性氧含量减少[52]。但该类研究受限于无法直接测量活性氧含量，因此无法进行活体试验。Vozenin等[53]认为，正常组织与肿瘤组织对FLASH放疗的不同反应是由于正常组织较低的促氧化剂负荷造成的。他们还发现，FLASH放疗对皮肤干细胞的影响最小，这与文献报道中FLASH放疗对神经[19]和肠道干细胞的[27]影响较小的结果一致。因此FLASH放疗对干细胞的保护可能也是正常组织损伤减少的潜在机制之一。Yang等[54]首次揭示了FLASH 放疗中肿瘤干细胞和癌细胞的杀伤作用和凋亡途径，这有助于未来临床上对FLASH放疗方案的优化。FLASH放疗的其他生物学效应还包括可显著减少促炎症基因的诱导、表达，减少DNA的持续性损伤，抑制照射导致的细胞衰老以及促进辐射损伤的修复等[33,55-56]。
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综上所述，尽管FLASH放疗具有巨大的临床应用潜力，并且有希望成为一种新型的放疗手段，但目前其生物学机制尚不清楚，技术条件也不成熟，因此如何使FLASH放疗的正常组织保护效应可靠、稳定地发挥作用还需要进行更多的研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陈欢负责综述的撰写、文献的收集与分析；郇福奎、门阔、戴建荣负责综述的修改；任雯廷负责撰写思路的指导、综述的审阅和最终版本的修订
Research progress of FLASH radiotherapy on protective effect for the normal tissue and the therapeutic effect for the tumor tissue
- Received Date: 2023-07-25
- Available Online: 2024-01-25
Abstract: Ultra-high dose rate (FLASH) radiotherapy is an innovation radiotherapy technique that has emerged as one of the revolutionary technologies in the field of radiotherapy over the past six years. It demonstrates excellent normal tissue protective effects without compromising the therapeutic efficacy on tumors. Moreover, the extremely short delivery time of FLASH radiotherapy helps eliminate the impact of organ or tumor motion on treatment accuracy, thereby enhancing treatment precision and patient comfort. This technology holds the potential to fundamentally transform the landscape of malignant tumor treatment. Currently, the underlying mechanism of the protective effects of FLASH radiotherapy on normal tissues are not fully understood. The authors present provide a comprehensive overview of the research progress in FLASH radiotherapy, encompassing both normal tissue protection and tumor treatment effects. Additionally, this paper provides insights into the potential biological mechanisms underlying the protection effects of FLASH radiotherapy. Consequently this paper serves as a valuable reference for further research in the field of FLASH radiotherapy.
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