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肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重影响人类健康[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%[2]。放疗是其主要的非手术治疗方法，但放射抵抗往往会导致局部肿瘤复发和预后不良[3-4]，目前尚无逆转NSCLC放射抵抗的有效靶点，亟需探究。
环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类在真核生物中广泛表达的环状非编码RNA，其由mRNA前体通过反向剪接产生。不同于其他线性非编码RNA，circRNA不具备5′端帽和3′端尾结构，对核酸外切酶具有抵抗性，故circRNA极具稳定性[5-6]。2011年，Salmena等[7]提出，circRNA具有微小RNA（microRNA，miRNA）反应元件，可作为竞争性内源性RNA海绵吸附并抑制miRNA，从而改变细胞的基因表达。circRNA还可以通过结合RNA结合蛋白、调节基因转录等方式来发挥作用，故其可参与基因转录、转录后调控、细胞内RNA调控网络及蛋白质翻译等生理过程，进而影响细胞周期进程、细胞衰老和凋亡等多种生物学过程[8]。
研究结果证实，circRNA在肺癌、胃癌、膀胱癌和乳腺癌等多种肿瘤中表达异常，其参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等多种生物学过程，因此circRNA被认为是一种潜在的肿瘤生物标志物及治疗靶点[9]。Wang等[10]发现，circRNA_0008305可诱导NSCLC细胞发生上皮间充质转化，进而促进肺癌转移。circRNA_0000199通过抑制miR-198上调磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1，以此增强胃癌细胞对铂类药物的耐药性[11]。另有研究结果证实，circRNA可能参与肿瘤的放射抵抗过程[12]。Ma等[13]发现，circRNA_0122683在食管癌组织中高表达，其通过调控miR-186-5p/腺苷二磷酸核糖聚合酶9（PARP9）轴调控细胞恶性程度并促进放射抵抗。circRNA_100367通过吸附miR-217增强食管癌细胞的放射抗性[14]。目前，针对circRNA与NSCLC细胞放射敏感性关系的研究尚不多见，circRNA_0128846对NSCLC细胞放射敏感性的影响不清楚。本研究探讨circRNA_0128846对人NSCLC细胞放射敏感性的调控作用及分子机制，以期为解决临床NSCLC放射抵抗问题提供潜在的治疗靶点。
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人支气管上皮细胞Beas-2B、人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975和人胚肾细胞293T均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养代次为10。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）、0.25%胰蛋白酶、表皮细胞生长因子、β-成纤维细胞生长因子、2% B27添加物均购自美国Gibco公司；青霉素和链霉素均购自浙江吉诺生物医药技术有限公司；Lipofectamine3000、Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司；SYBR Green PCR试剂盒购自日本Takara公司；RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司；CCK-8试剂盒、RNA反转录试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；miR-1183抑制剂、miR-1183模拟物及阴性对照均购自苏州吉玛基因股份有限公司。NanoDrop2000分光光度计、酶联免疫分析仪均购自美国Thermo公司；X-RAD 320直线加速器购自美国North Branford公司。质粒（LUC）购自上海和元生物技术股份有限公司；引物购自广州生工生物工程股份有限公司。双荧光素酶报告基因分析系统购自美国Promega公司。
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人支气管上皮细胞Beas-2B和人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975分别培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml链霉素的DMEM培养基中；人胚肾细胞293T培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件均为37℃、5% CO2。放射抵抗细胞系是本实验室前期经分割辐射（2 Gy×30次）诱导而成的，已建立具有稳定放射抵抗能力的人NSCLC细胞A549（命名为A549R），并每2周给予低剂量（2 Gy）照射以维持细胞的辐射抗性，照射条件为6 MV X射线，剂量率为4 Gy/min。
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在GEO数据库（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo ）中下载微阵列数据集GSE101684，筛选出在4对癌组织与癌旁正常组织中差异表达最显著的10种circRNA[筛选标准为log2FC（折叠变化）≥1.5，且P<0.05]，选择在亲本细胞和放射抵抗细胞中表达差异最显著的circRNA作为目标circRNA。利用人类环状RNA数据库（http://www.circbank.cn ）和circinteractome数据库（https://circinteractome.nia.nih.gov ）预测目标circRNA下游的miRNA，筛选出沉默目标circRNA后，表达水平上升最显著的miRNA作为目标miRNA。 -
将人NSCLC细胞A549、A549R接种于6孔培养板中（1×105个/孔），培养至50%~70%融合度后转染，转染操作按照Lipofectamine3000说明书进行。对A549R细胞进行转染，目标circRNA沉默载体为pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA，干扰序列为5′-TCCAAGCTGGCCAGCAGCCAGC-3′；对A549细胞进行转染，目标circRNA过表达载体为pIRES-hrGFP-1a，目标circRNA过表达序列见“
http://www.circbank.cn/search.html?selectValue=has_circ_0128846 ”。使用miRNA抑制剂转染A549细胞以实现miRNA沉默；使用miRNA模拟物转染A549R细胞以实现miRNA过表达，转染对照组均为空载体。 -
将转染后24 h的人NSCLC细胞A549、A549R各分为3组进行照射，照射剂量分别为0、4、8 Gy，照射后将细胞接种于6孔低吸附培养板中（1×104个/孔），使用DMEM/F12无血清培养基培养，培养基中加入50 ng/ml表皮细胞生长因子、10 ng/ml β-成纤维细胞生长因子和2% B27添加物。培养7 d后在显微镜下拍照分析，以细胞克隆最大径>20 μm为判定标准，统计细胞克隆形成率（细胞克隆形成率=细胞克隆数/细胞总数×100%）[15]。
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使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，使用NanoDrop2000分光光度计检测纯化的总RNA的质量和浓度。按照RNA反转录试剂盒说明书提取RNA，并进行反转录合成互补DNA（cDNA）。采用SYBR Green PCR试剂盒检测细胞中在人NSCLC癌组织与配对的癌旁正常组织中差异表达的10种circRNA以及可能与目标circRNA结合的miRNA的表达水平，操作按照说明书进行。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）作为目标circRNA的参考基因，U6作为目标miRNA的参考miRNA。PCR反应条件：94℃预变性1 min，94℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。引物序列如表1所示。
引物名称 引物序列 GADPH F: 5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′ R: 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′ circRNA_0128846 F: 5′-GACCTCTGTCAGCGAGTTCC-3′ R: 5′-GCTACTGGAGCCTGATGGAC-3′ circRNA_0116061 F: 5′-GAGATGGAACAGCACGGATT-3′ R: 5′-GGCAGATTTGCAAAAGATGA-3′ circRNA_0116961 F: 5′-TCGAATTGTCAAGATGTGGAA-3′ R: 5′-AAAAACCTGATTGCGAATGAA-3′ circRNA_0106711 F: 5′-TAATCCCAGGAGTCCAGCTC-3′ R: 5′-ACGAGTGCTGCTTTGGTCTT-3′ circRNA_0106714 F: 5′-GGACAGCAGGCATTACCAAT-3′ R: 5′-CCAATTTCCAAAGCCACAGT-3′ circRNA_0094088 F: 5′-CCTTTGAAGATGGCCTCTGA-3′ R: 5′-CACAGACGAGTGGGTTCACA-3′ circRNA_0096041 F: 5′-TTGGTCCAATCTGCTTCACC-3′ R: 5′-GTTCACATCGGGATCCTTGT-3′ circRNA_0046264 F: 5′-TTGGTCCAATCTGCTTCACC-3′ R: 5′-GTTCACATCGGGATCCTTGT-3′ circRNA_0096042 F: 5′-CCCGCTGGTGAAGTCTCTAT-3′ R: 5′-TGGCTACTGAACCAGTCACG-3′ circRNA_0096049 F: 5′-GGATGTTTCTCTGCCCAAAA-3′ R: 5′-TTTGGGTCCCTTGAATTTACC-3′ miR-646 F: 5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCAGCTGCCTC-3′ R: 5′-CTCAACTGTGCTGCATTAGTTAGCTCAGA-3′ miR-885-3p F: 5′-GAGCACGAGGCAGTAGGCAAAGTGT-3′ R: 5′-GAGGCAGCGGGGTGTAGTGGATAGA-3′ miR-578 F: 5′-GTGCAGGGTGTTAGGA-3′ R: 5′-GAAGAACACGTCTGGT-3′ miR-647 F: 5′-GTGTTGGCCTGTGGCTG-3′ R: 5′-CTGACCCTCCCTCCTGC-3′ miR-892a F: 5′-GCCGAGCACTGTGTCCTTT-3′ R: 5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′ miR-1183 F: 5′-ACTGACCACTGTAGGTGATGG-3′ R: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG-3′ miR-1827 F: 5′-GGTGAGGCAGTAGATTGAATCTC-3′ R: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′ miR-532-3p F: 5′-GCCCATGCCTTGAGTGTAG-3′ R: 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′ miR-626 F: 5′-CTTATTTGAGAGCTGAGGA-3′ R: 5′-CGGACTAGTACATCATCTATACTG-3′ U6 F: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ R: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′ 注：GADPH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；circRNA为环状RNA；miR为微小RNA Table 1. Primers sequences used in fluorescence real-time quantitative polymerase chain reaction
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质粒在荧光素酶基因启动子（LUC-目标circRNA）下游插入序列5′-CUUACAGUAC-3′（目标circRNA中miRNA的潜在结合序列）。将293T细胞接种于24孔培养板中（5×104个/孔），将LUC-目标circRNA与miRNA模拟物或miRNA阴性对照共转染293T细胞，48 h后裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因分析系统测定荧光素酶活性。
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应用SPSS 23.0软件、GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以
$\bar x \pm s $ -
由图1A可见，经GEO数据库微阵列数据集GSE101684（包括4对癌组织与配对的癌旁正常组织）筛选，在人NSCLC癌组织中表达上调的前10种circRNA分别为circRNA_0116061、circRNA_0116961、circRNA_0106711、circRNA_0106714、circRNA_0128846、circRNA_0094088、circRNA_0046264、circRNA_0096041、circRNA_0096042和circRNA_0096049。qRT-PCR结果显示，上述10种circRNA中，circRNA_0116961、circRNA_0106714、circRNA_0128846和circRNA_0046264在A549R细胞中的相对表达水平均高于A549细胞（均P<0.05），其中circRNA_0128846表达差异最显著（图1B）。故本研究选择circRNA_0128846作为目标circRNA。qRT-PCR检测circRNA_0128846在正常人支气管上皮细胞Beas-2B以及人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975中的相对表达水平，结果显示，circRNA_0128846在A549、H460、H1299、H1975细胞中的相对表达水平均高于Beas-2B细胞（均P<0.01，图1C）。以上4株人NSCLC细胞的克隆形成实验结果显示，经0、4、8 Gy的X射线照射后，随着circRNA_0128846表达水平的升高，4株人NSCLC细胞的克隆形成能力逐渐增强（图2），这提示circRNA_0128846的高表达可能与人NSCLC细胞的放射抵抗呈正相关。
Figure 1. Screening target circRNA and detecting its expression in normal human bronchial epithelial cell Beas-2B and human non-small cell lung cancer cell A549, H460, H1299, H1975
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细胞克隆形成实验结果显示，在4、8 Gy X射线的照射下，A549R细胞的辐射抗性显著高于亲本A549细胞（均P<0.05，图3）。qRT-PCR检测结果表明，在A549细胞中成功过表达了circRNA_0128846（图4A），与对照组相比，过表达circRNA_0128846显著增强了A549细胞的克隆形成能力（0.22%对0.45%，图4B）；在A549R细胞中成功沉默了circRNA_0128846（图5A），与对照组相比，沉默circRNA_0128846显著降低了A549R细胞的克隆形成能力（0.23%对0.10%，图5B），该结果提示circRNA_0128846能够促进人NSCLC细胞的放射抵抗。
Figure 2. Clone formation in normal human bronchial epithelial cells Beas-2B and human non-small cell lung cancer cell A549, H460, H1299, H1975 after irradiation with different doses of X-ray radiation (×200)
Figure 3. Clone formation in human non-small cell lung cancer cell A549 and its radioresistant cell A549R after irradiation with different doses of X-ray radiation (×200)
Figure 4. Relative expression level of circRNA_0128846 overexpression vector transfected human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)
Figure 5. Relative expression level of circRNA_0128846 silencing vector transfected the radioresistant cell (A549R) of human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)
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在circinteractome数据库和人类环状RNA数据库中取交集得到9种可能与circRNA_0128846结合的潜在miRNA。qRT-PCR检测A549R细胞中circRNA_0128846沉默后各miRNA的表达，结果显示，沉默circRNA_0128846可上调miR-1183和miR-1827的表达（t=5.095、3.464，P=0.007、0.026），其中miR-1183表达上调最显著，该结果提示circRNA_0128846可能与miR-1183结合，并下调其表达。采用生物信息学预测circRNA_0128846与miR-1183潜在的结合位点如图6所示。qRT-PCR检测结果表明，在A549细胞中过表达circRNA_0128846可显著下调miR-1183的表达（t=6.002，P=0.004）。在人胚肾293T细胞中进行双荧光素酶报告基因分析的结果显示，过表达miR-1183可显著降低circRNA_0128846的表达（t=4.562，P=0.010），这提示miR-1183可以与circRNA_0128846结合并下调其表达。经qRT-PCR验证，miR-1183在A549R细胞中的表达水平显著低于A549细胞（t=6.025，P=0.004），这提示miR-1183可能与人NSCLC细胞的放射抵抗有关。
Figure 6. Bioinformatics prediction of the binding site of circRNA_0128846 and miR-1183
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经qRT-PCR验证，使用miR-1183抑制剂成功对A549细胞进行了miR-1183沉默，沉默miR-1183显著增强了8 Gy X射线照射后A549细胞的克隆形成能力（0.21%对0.31%，图7）；同时，使用miR-1183模拟物成功对A549R细胞进行了miR-1183过表达，过表达miR-1183显著降低了8 Gy X射线照射后A549R细胞的克隆形成能力（0.26%对0.15%，图8），这提示miR-1183可抑制人NSCLC细胞的放射抵抗。过表达circRNA_0128846可显著增强8 Gy X射线照射后A549细胞的克隆形成能力（P<0.01），而过表达miR-1183逆转了circRNA_0128846诱导的放射抵抗（1.90%对1.20%，图9），这表明circRNA_0128846可以通过介导miR-1183促进人NSCLC细胞的放射抵抗。
Figure 7. Relative expression level of miR-1183 inhibitor transfected human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)
Figure 8. Relative expression level of miR-1183 mimic transfected the radioresistant cell (A549R) of human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)
Figure 9. Clonal formation ability of human non-small cell lung cancer cell A549 after overexpression of circRNA_0128846 and miR-1183 (×200)
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越来越多的研究结果表明，circRNA在许多恶性肿瘤的发生发展中起着关键的调节作用[16]。随着高通量测序及先进的生物信息学技术的发展，许多circRNA被鉴定出来，这使得circRNA与肿瘤的关系比以往更受关注。circRNA的异常表达已被证实与NSCLC的进展有关，如circRNA_100876在NSCLC组织中的表达水平明显高于邻近的非肿瘤组织，circRNA_100876的表达上调与NSCLC患者的淋巴结转移和肿瘤分期有关[17]。此外，circRNA_100876表达水平较高的NSCLC患者的总生存时间明显短于circRNA_100876表达水平较低的NSCLC患者[17]，故某些circRNA对NSCLC的发生、发展及诊断治疗可能有重大意义。目前，关于circRNA_0128846与肿瘤的关系仅有1篇文献报道，其研究结果显示，circRNA_0128846在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常组织，circRNA_0128846通过下调miR-1184的表达来增加LIM结构域蛋白（AJUBA）的表达，使得Hippo/Yes相关蛋白（YAP）通路信号失活，从而促进结直肠癌的发生[18]。在本研究中，我们通过生物信息学分析发现circRNA_0128846在人NSCLC细胞中显著高表达。
目前，关于circRNA与肿瘤放射敏感性关系的报道还不多见。研究结果表明，circZNF609在前列腺癌组织和细胞系中异常上调，其通过调控miR-501-3p/已糖激酶2（HK2）轴促进糖酵解代谢，从而增强前列腺癌细胞的放射抵抗[19]。circ_0086720通过靶向miR-375/纺锤体蛋白1（SPIN1）轴促进NSCLC放射抵抗[20]。下调circ_CCNB2可抑制miR-30b-5p/驱动蛋白家族成员18A（KIF18A）轴介导的细胞自噬，增强前列腺癌细胞的放射敏感性[21]。在本研究中，我们发现circRNA_0128846在人NSCLC放射抵抗细胞中显著高表达，沉默circRNA_0128846能显著增强人NSCLC细胞的放射敏感性，过表达circRNA_0128846能显著降低人NSCLC细胞的放射敏感性，circRNA_0128846可作用于miR-1183，促进人NSCLC细胞的放射抵抗。
circRNA发挥生物学功能的重要途径之一就是作为分子海绵吸附miRNA。大量研究结果证实miRNA参与炎症[22]、心脏病[23]、肿瘤[24]等多种疾病的发生、发展。目前，关于miR-1183的研究还较少。miR-1183可通过调控B细胞淋巴瘤基因2（Bcl2）的表达参与风湿性心脏病的发生、发展过程[25]。在肿瘤中，miR-1183是circRNA_0073239和circRNA_0005273调控肿瘤细胞增殖、迁移、糖酵解的重要下游靶标[26-28]。Zhu等[26]的研究结果表明，miR-1183是circRNA_0073239介导胶质瘤放射抵抗的下游靶标。本研究通过人类环状RNA数据库和circinteractome数据库预测并验证了circRNA_0128846的下游靶标miR-1183，并发现其可能是circRNA_0128846介导人NSCLC细胞放射抵抗的重要靶标。我们发现，通过过表达miR-1183显著增强了人NSCLC细胞的放射敏感性，而沉默miR-1183显著降低了人NSCLC细胞的放射敏感性。
关于miR-1183下游靶标的研究不多，B细胞淋巴癌基因2（Bcl2）和磷脂酰肌醇依赖性激酶1（pPDPK1）是miR-1183的下游靶标。在前期，我们通过TargetScan和miRbase数据库分析预测了miR-1183可能的下游靶标，其中包括鼠双微体2（mouse double minute 2，MDM2）和缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1），这些基因已被证实参与肿瘤的放射抵抗[29-30]。MDM2作为一种癌基因，能调节抑癌基因p53对细胞周期和凋亡的调控[31]。多项研究结果表明，MDM2在肿瘤对辐射反应的过程中发挥关键作用[32]。HIF-1是一种关键的转录因子，可使肿瘤细胞适应缺氧条件[33]。放疗可以加速HIF-1的激活，而HIF-1反过来可通过多条信号途径影响辐射反应[34-35]。这些基因可能是miR-1183调控肿瘤放射敏感性的重要靶标。本研究中，circRNA_0128846在人NSCLC放射抵抗细胞中的表达显著上调，而miR-1183的表达下降，circRNA_0128846可通过靶向结合并抑制miR-1183的表达，进而降低人NSCLC细胞的放射敏感性，这提示circRNA_0128846在NSCLC的放射抵抗中发挥重要作用，其可能成为一种潜在的治疗靶点，但具体的作用机制还需进一步探究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陆滢负责实验的实施、论文的撰写；邓鑫州负责图像的分析、数据的处理、论文最终版本的修订；宋仕茂负责生物信息学的分析、论文摘要的校对；骆志国负责命题的提出、论文的审阅
The study of circRNA_0128846 targeting miR-1183 to mediate radioresistance in human non-small cell lung cancer cells
- Received Date: 2020-11-14
- Available Online: 2022-01-25
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