Role of angiogenin-like proteins in tumorigenesis and development

迄今为止，已发现ANGPTLs家族有8个成员（ANGPTL1~8），它们的化学结构均与血管生成素相似。由于ANGPTLs不与血管生成素的酪氨酸激酶受体Tie1和Tie2结合，因此也被称为“孤儿配体”^[2]。除ANGPTL8缺少羧基末端C端纤维蛋白原样结构域（C-terminal fibrinogen-like domain，cANGPTL），其他ANGPTLs家族成员均具有3个保守结构域：N端卷曲螺旋结构域（N-terminal coiled-coil domain，nANGPTL）、卷曲螺旋结构域和cANGPTL。其中ANGPTL3、4、8的蛋白结构中还存在脂蛋白脂肪酶特定抗原决定基，其与抑制脂蛋白脂肪酶的活性有关^[3]。随着研究的深入，整合素（β1、β5、α5β1、αvβ3）、纤连蛋白、玻连蛋白等被证明是部分ANGPTLs成员的受体^[4-5]。白细胞免疫球蛋白样受体也被证实为ANGPTL2、5、7的受体^[6]，ANGPTLs可通过nANGPTL的寡聚化触发白细胞免疫球蛋白样受体信号，维持正常成体干细胞的干性，并在调控肿瘤的发生发展中发挥重要功能。

ANGPTLs广泛表达于脂肪、胚胎、血管组织及造血系统等，其生物学特性因结构不同而存在差异。在正常细胞中，ANGPTLs对脂质、葡萄糖和能量的代谢及血管生成的调控较为显著：ANGPTL3、4、5、6、8均具有调节脂质代谢的功能^[7]；除ANGPTL5、8外，其余ANGPTLs均具有调控血管生成的功能；此外，ANGPTL3、4、6、8均可直接影响葡萄糖和能量的代谢。众所周知，正常细胞的增殖和迁移是维持机体稳态的关键，该过程受到多种调控因子和信号通路的严密调控。Lee等^[8]研究发现，斑马鱼肝脏中ANGPTL3的突变可导致其肝脏发育缺陷，如进一步敲除ANGPTL3基因，肝细胞的增殖会受到抑制，进而导致肝脏发育异常。过表达ANGPTL7可调控骨形成蛋白的表达，进而促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖与矿化^[9]。此外，ANGPTL4能够结合整合素β1、β5，通过激活局部黏着斑激酶（FAK）-酪氨酸激酶（Src）-丝/苏氨酸激酶（PAK1）信号通路诱导角质形成细胞迁移，促进伤口愈合^[10]。尽管ANGPTLs不与血管生成素和（或）Tie受体结合，但其大多数成员仍具有调节血管生成的功能。此外，ANGPTLs在调控脂质、葡萄糖和能量的代谢，促进癌症的发展和转移中同样发挥关键作用。

肿瘤的发生发展受到多种因子的密切调控，其中血管生成、侵袭转移和细胞凋亡失衡是恶性肿瘤重要的生物学特征，也是导致肿瘤患者治疗效果不佳的主要原因。

肿瘤的血管生成对肿瘤的生长至关重要，其可为肿瘤组织提供新陈代谢必需的氧气与营养，使肿瘤组织迅速生长并为其远端转移提供基础。有研究结果表明，肿瘤的血管生成受到正负调节因子的严密调控，包括基底膜局部损伤、血管生成因子激活、内皮细胞迁移增殖等多种生物学过程^[11]。ANGPTLs家族中的ANGPTL1、2、3、4、6、7可能与血管生成调控有关，但具体作用因蛋白功能的特异性和组织环境而有所差异。ANGPTL1作为一种抑癌基因，通过抑制肿瘤组织中血管的生成发挥抑癌作用，而ANGPTL2、3、6、7是一类正向调控血管生成的重要因子^[12]。目前，对ANGPTL4的研究较多，但对其介导的调节血管生成的作用仍存在争议。ANGPTL4在分泌后被前蛋白转化酶水解，释放nANGPTL4和cANGPTL4，前者调节脂质代谢和葡萄糖稳态，后者独立于nANGPTL4，在肿瘤发展中发挥重要作用，但其具体机制尚不清楚。Okochi-Takada等^[13]研究发现，肿瘤来源的ANGPTL4可以通过抑制细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号，明显抑制体外培养的人脐静脉内皮细胞血管的形成和增殖，进而抑制肿瘤生长，这提示ANGPTL4可通过抑制肿瘤的血管生成发挥对肿瘤的抑制作用。然而，Katanasaka等^[14]研究发现，在恶性神经胶质瘤细胞中，ANGPTL4可通过表皮生长因子受体（EGFR）突变体Ⅲ激活ERK/c-Myc通路而高表达，进而促进恶性胶质瘤微血管的生成和肿瘤的发展。

ANGPTLs家族对肿瘤血管生成有一定的调节作用，但可能与肿瘤细胞的类型、分化程度和肿瘤微环境相关，其具体机制仍需进一步研究。

肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是导致患者病死的首要原因。除ANGPTL8外，ANGPTLs家族中大部分蛋白均在肿瘤的侵袭转移中扮演重要角色。

ANGPTL1可降低肿瘤细胞的迁移与侵袭能力，抑制上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程。Chen等^[15]研究发现，ANGPTL1在肝癌中的表达与肿瘤对索拉非尼的敏感性呈正相关，且其能够直接与EMT受体相互作用并使后者失活，同时可通过抑制细胞外ERK/蛋白激酶B（AKT）依赖的早期生长反应蛋白1（Egr-1）抑制Slug的表达，进而抑制肿瘤的侵袭转移。此外，Kuo等^[16]通过miRNA微阵列分析筛选证明，ANGPTL1亦可通过诱导miR-630抑制Slug，从而降低肺癌和乳腺癌的侵袭和转移能力。

Sheng等^[17]通过研究比较胃癌组织与正常组织发现，在胃癌组织中，ANGPTL2的表达水平明显上调，且其与肿瘤分级、临床分期及淋巴结转移密切相关，过表达ANGPTL2的胃癌细胞的侵袭转移能力显著增强。Carbone等^[18]研究发现，ANGPTL2在维持EMT过程和胰腺肿瘤前病变细胞的早期转移行为中起关键作用，并证明ANGPTL2在胰腺导管腺癌的早期发现、转移预防和治疗中具有潜在作用。ANGPTL2在结直肠癌、胃癌和胰腺癌中均高表达，并可促进癌细胞的侵袭转移，具有临床诊断及预后评估的重要价值。

ANGPTL4在肿瘤侵袭转移中的作用机制因其蛋白结构的复杂性及肿瘤组织的特异性仍存在争议。Tanaka等^[19]研究发现，口腔鳞状细胞癌细胞中的ANGPTL4在mRNA和蛋白水平上的表达均增加，可通过刺激细胞侵袭促进肿瘤的转移。当非小细胞肺癌细胞中的ANGPTL4被抑制后，ERK信号通路进一步被抑制，钙黏连蛋白E的表达增加，波形蛋白减少，非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱^[20]。有研究者在持续分泌ANGPTL4的小鼠体内观察到，ANGPTL4能够抑制肿瘤细胞从原发灶向淋巴管或血管中内渗、淋巴管外渗，并可降低肿瘤血管通透性以阻止肿瘤转移；另外，ANGPTL4能以自分泌的形式抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭、黏附和细胞骨架重组。ANGPTL4可通过抑制血管活性、肿瘤细胞活性及其侵袭性，阻止肿瘤细胞的迁移^[21]。

虽然关于ANGPTL5、6、7在恶性肿瘤细胞侵袭转移方面的研究甚少，但在肝脏中，ANGPTL6也可通过与肿瘤整合素α6和（或）钙黏蛋白E的相互作用促进结直肠癌的肝转移^[22]。ANGPTL7已被证明是肿瘤转移进程的介导因子，并且是干扰肝转移的潜在靶标，其过表达显著降低了肿瘤细胞的致瘤能力以及肝转移能力^[23]。

基于上述研究结果，ANGPTLs家族在肿瘤侵袭转移过程中具有重要的介导作用，可通过多条信号通路影响肿瘤的发展。

细胞凋亡是细胞发育中重要的生理过程，受到一系列复杂基因群的严格调控，该过程的失衡与恶性肿瘤的进展密切相关，规避细胞凋亡是恶性肿瘤的本质特征之一。Yan等^[24]研究发现，ANGPTLs家族可参与肿瘤细胞凋亡的调节过程。ANGPTL1可通过抑制信号传导与转录激活因子（STAT3）/B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）介导的抗凋亡通路促进肿瘤细胞的凋亡，而ANGPTL2可通过酪氨酸激酶（Syk）-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路诱导Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，使其对化疗产生抗性^[25]。目前，关于ANGPTL4在肿瘤细胞凋亡进展中的报道甚多。有研究者发现，油酸和表皮生长因子均能诱导ANGPTL4蛋白的表达和分泌，并显著增强头颈部鳞状细胞癌的抗凋亡能力^[26]；而抑制胃癌细胞中ANGPTL4的表达可以促进胃癌细胞的凋亡^[27]。另外，ANGPTL6、8同样具有调节肿瘤细胞凋亡的能力：下调产甲胎蛋白胃癌（AFPGC）细胞系中ANGPTL6的表达，细胞的凋亡水平显著降低^[28]。外源性重组ANGPTL8蛋白可促进肝癌HepG2细胞的早期与晚期凋亡^[29]。

综上所述，ANGPTLs家族能够调控肿瘤细胞的凋亡水平，进一步影响恶性肿瘤的发生发展过程。ANGPTLs对肿瘤进展的调控作用为我们在基因和蛋白水平上进一步认识肿瘤细胞的生长和恶化进程以及挖掘肿瘤治疗的新靶点提供更多的可能性。

肿瘤微环境是由多种非恶性细胞（内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞等）、细胞因子、细胞外基质、肿瘤细胞与周围血管等交织形成的独特的环境网络，具有组织乏氧、pH降低、间质高压、炎症反应等特点，对肿瘤的发生发展以及治疗效果具有深远的影响。局部乏氧区域的存在是肿瘤微环境最普遍的特征之一，其能通过改变基因表达、血管生成、增强酪氨酸激酶受体下游信号通路、EMT等方式影响肿瘤的生长、侵袭与转移，并被认为是导致肿瘤细胞辐射抵抗的主要原因之一^[30]。其中，乏氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）表达的增加是乏氧微环境的重要标志，其通过激活下游靶基因参与肿瘤细胞凋亡、细胞周期调控、葡萄糖代谢重编程以及激活血管生成因子，进而新生成血管等过程，增强肿瘤细胞辐射抵抗的能力。有研究者发现，肺癌A549细胞经乏氧处理后，HIF-1α的表达显著上调，并诱导赖氨酸氧化酶的表达，增强双链断裂的修复，抑制细胞凋亡，促进细胞G2/M周期阻滞，进而介导乏氧肺癌细胞的辐射抵抗^[31]。另外，HIF-1还可通过上调血管紧张素Ⅱ、β-连环蛋白的核易位和葡萄糖代谢的重编程等影响肿瘤细胞的辐射抗性^[32]。

近年来，诸多研究结果表明，ANGPTLs家族成员在肿瘤乏氧微环境中发挥重要作用。Hu等^[33]研究发现，在乏氧环境下，葡萄膜黑色素瘤细胞中的HIF-1可上调ANGPTL4的表达，进而促进血管生成与肿瘤细胞的转移。肝癌细胞中ANGPTL4的表达与HIF-1α的稳定性正相关，且ANGPTL4可通过激活血管细胞黏附分子1（VCAM-1）/整合素β1信号通路，促进肝癌细胞的转移^[34]。Baba等^[35]研究发现，在乏氧的硬化性胃癌细胞中，ANGPTL4沉默可下调c-Myc和上调p27，诱导细胞G1期阻滞，且细胞成瘤能力被强烈抑制。另外，在肥胖诱导的乳腺癌中，乏氧能与白细胞介素1β协同上调ANGPTL4的表达，显著促进恶性肿瘤的增殖和血管生成，进而影响肿瘤的进程，通过基因敲除或抗体结合ANGPTL4可明显降低上述效应^[36]。在结直肠癌细胞中，干扰HIF-1α的表达可进一步逆转ANGPTL4的过表达水平^[37]，这提示ANGPTL4可能是肿瘤乏氧微环境中影响肿瘤进展的重要驱动因子。此外，Mo等^[38]在乏氧及照射处理的肺癌A549细胞的外泌体中检测到特异性高表达的ANGPTL4蛋白，其携带的ANGPTL4外泌体可促进未受乏氧和辐射处理的肿瘤细胞的增殖、侵袭转移及人脐静脉内皮细胞的成管能力，进一步介导辐射抵抗。邓红彬等^[39]亦发现，在舌癌Tca8113细胞中，利用反义技术抑制ANGPTL4基因后，照射诱导的细胞集落形成率下降且凋亡率升高，同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，进而提高肿瘤细胞对辐射治疗的敏感性。

ANGPTL4作为HIF-1的靶基因，在肿瘤微环境介导的肿瘤发生发展中具有关键的调节作用，也为后续广泛研究ANGPTLs家族参与肿瘤微环境介导肿瘤发生发展及探索肿瘤新的治疗靶点提供了重要的理论依据。

肿瘤的发生发展受到复杂的调控因子、信号通路和微环境的调节，涉及血管生成、细胞凋亡、侵袭转移等多个生物学过程，对其作用机制以及治疗靶点的探讨一直是生命科学领域的研究热点与重点。近年来，ANGPTLs家族显示出极高的研究价值。ANGPTLs是以自分泌和（或）旁分泌方式发挥作用的分泌型蛋白，其在肿瘤微环境中对肿瘤的生长和转移具有重要的调节作用。因此，将肿瘤组织中的ANGPTLs作为靶点的治疗策略，可能比针对肿瘤本身以及肿瘤微环境中的细胞更为有效。但因ANGPTLs结构的特异性以及功能的多元化，其具体的分子机制仍有待进一步阐明。基于目前的研究进展，ANGPTLs家族在影响肿瘤的发生发展方面的机制研究仍面临诸多挑战。一方面，ANGPTLs经蛋白水解酶裂解产生的两个片段在肿瘤发展中的作用不同；另一方面，其分泌具有组织特异性，在不同肿瘤组织类型中表现出不同的生物学功能。因此，若将ANGPTLs家族作为肿瘤的临床诊断、预后标志物以及肿瘤治疗的新靶点，仍需对其在肿瘤组织中的信号通路以及分子机制做深入的研究。

利益冲突　本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明　张育红负责文献的收集与整理、综述的撰写；邵春林、张江虹负责综述的修改与审阅。