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近年来，免疫治疗成为继手术、放疗、化疗及靶向治疗之后一种全新的肿瘤治疗模式。肿瘤免疫治疗通过调节、激活免疫系统，从而杀灭或控制肿瘤[1]。在肿瘤免疫治疗的研究进展中，免疫检查点抑制剂，尤其是程序化细胞死亡受体-1（programmed cell death-1, PD-1）/程序化细胞死亡配体-1（programmed cell death ligand-1, PD-L1）抑制剂受关注最多。
研究显示，免疫检查点如PD-1/PD-L1的表达水平与肿瘤预后不良以及肿瘤免疫治疗效果有关[2]。分子影像学能够实时检测肿瘤生物靶点，准确评估肿瘤生物靶点表达的动态变化情况。分子影像学技术，如PET、SPECT、MRI及光学成像已被用于肿瘤免疫检查点显像的临床前及临床研究[3]。笔者总结了近年来在肿瘤分子影像学领域关于PD-1/PD-L1免疫检查点的研究进展。
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PD-1是由288个氨基酸组成的细胞膜表面分子，是CD28家族成员之一，是一类重要的免疫检查点受体，主要表达于激活的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞表面，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用[4]。目前已经发现的PD-1配体包括PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是其最主要的配体。PD-L1是一种相对分子质量为40的跨膜蛋白，广泛表达于活化的T细胞、B细胞、抗原提呈细胞、巨噬细胞等。在多种类型的肿瘤，如乳腺癌、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC)、胃癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌等组织中也可检测到PD-L1表达，并且高于正常组织的PD-L1表达水平[5]。
在正常人体内，PD-1/PD-L1信号通路对维持机体免疫平衡起重要作用。在肿瘤发生发展过程中，PD-1/PD-L1信号通路被异常激活，抑制肿瘤抗原的特异性T细胞活化，抑制T细胞受体信号传递，下调抗凋亡分子和炎症因子表达，导致肿瘤细胞逃离机体免疫系统的监视，促进肿瘤快速增殖、转移[6]。
有针对性地阻断PD-1/PD-L1信号通路，解除T细胞活性受抑制状态，促进T细胞活化，能够达到内源性抗肿瘤效应。目前已有多个PD-1/PD-L1单抗药物上市或进入临床试验。例如美国食品药品监督管理局在2014年批准上市应用于晚期黑色素瘤的纳武单抗（Nivolumab）和派姆单抗（Pembrolizumab）以及2018年9月批准上市用于治疗皮肤鳞状细胞癌的Cemiplimab，都是靶向PD-1的人源化单克隆抗体。美国食品药品监督管理局在2016年批准上市了用于治疗特定类型膀胱癌的靶向PD-L1阿特朱单抗（Atezolizumab），在2017年批准了另两个PD-L1抑制剂得瓦鲁单抗（Durvalumab）和阿维鲁单抗（Avelumab）[7-9]。
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2016 年，Antonia 等[10] 进行的一项评估 Nivolumab单药或Nivolumab联合Ipilimumab治疗复发性小细胞肺癌的有效性和安全性的多中心、开放标签的I/II期临床试验（CheckMate032）发现，试验各组的客观缓解率为10%~33%，PD-L1表达阳性的患者接受PD-1单抗治疗的有效率更高[10]。另一项关于Pembrolizumab的II/III期随机对照临床试验（KEYNOTE-010）纳入1034例既往接受治疗的PD-L1表达阳性的进展期NSCLC患者，结果显示随PD-L1表达水平的升高，患者的总生存期显著延长[11]。一项纳入7项研究的Meta分析显示，肿瘤细胞PD-L1染色≥1%的NSCLC患者具有更高的客观缓解率[12]。尽管PD-1/PD-L1抑制剂在多种肿瘤的治疗中取得了良好效果，但仍有许多患者对治疗不敏感，抗体治疗还会导致一系列免疫相关的不良反应，如自身免疫性肝炎、自身免疫性糖尿病、垂体炎、甲状腺机能减退、肺炎、结肠炎等。因此，如何筛选免疫治疗获益人群是进行精准治疗的关键，临床试验结果显示，PD-L1表达阳性可能是免疫治疗潜在有效的生物靶标。
目前，检测肿瘤组织PD-L1和肿瘤浸润淋巴细胞PD-1的表达水平主要是通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）方法，美国食品药品监督管理局已批准的用于PD-L1检测的IHC试剂盒包括Dako22c3、Dako28-8、Dako73-10、VentanaSP142和Ventana SP263。但IHC检查的局限性包括：操作有创；无法对肿瘤进展过程中的PD-L1表达水平进行重复、动态监测；各种IHC试剂盒检测平台不一致，对PD-L1阳性的判断标准不同[13]。由于肿瘤的异质性，原发灶与转移灶的PD-L1表达可能不同，IHC检测只能提供活检区域的信息（通常为原发灶），无法对所有病灶进行穿刺，可能出现假阴性结果。有研究显示，在IHC提示PD-L1表达阴性的患者中，大约10%对抗PD-1/PD-L1治疗有良好反应[14-15]。分子影像学技术具有无创、定量定位、实时、可重复、同时显示原发灶和转移灶的优点，因而成为活体内检测PD-1/PD-L1表达的研究热点。
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PET显像能定量、无创地检测放射性药物在活体内的药代动力学，其灵敏度高、空间分辨率高，因此在肿瘤免疫显像中发挥重要作用。常用于标记单克隆抗体的正电子核素包括64Cu（半衰期12.7 h）、68Ga（半衰期68.1 min）、89Zr（半衰期3.7 d）等。
Natarajan等[16]用64Cu标记的抗鼠源PD-1单克隆抗体对B16-F10黑色素瘤小鼠表达PD-1的肿瘤浸润淋巴细胞进行PET显像，在接受示踪剂注射后，小鼠淋巴组织和肿瘤部位的放射性摄取明显提高，注射后48 h的生物分布试验结果显示肿瘤/肌肉摄取比值为11。PD-1肿瘤的摄取为（7.4 ± 0.7）%ID/g，注射未标记抗体阻断后肿瘤摄取下降20%。这是靶向PD-1免疫检查点PET显像的首次报道，也为之后PD-1靶向显像奠定了基础。该研究团队用89Zr和64Cu标记Pembrolizumab制成靶向PD-1的正电子显像剂，在输入人外周血单核细胞的荷人类黑色素瘤A375细胞的免疫缺陷小鼠中注射显像剂后，PET/CT显示小鼠脾脏、淋巴器官和肿瘤部位均有较高的放射性摄取，提示肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤部位的高度聚集[17]。
Chatterjee等[18]用64Cu标记靶向PD-L1的阿特朱单抗（Atezolizumab）对乳腺癌PD-L1表达进行了PET显像，结果显示，64Cu-Atezolizumab在PD-L1高表达的乳腺癌MDA-MB-231中的摄取明显高于PD-L1低表达的乳腺癌SUM149。Donnelly等[19]制备了一种新型靶向PD-L1的正电子药物18F-BMS-986192，在裸鼠双侧前肢皮下分别种植PD-L1表达阳性的人肺癌细胞L2987和PD-L1表达阴性的人结肠癌细胞HT-29，小动物PET显像提示，在注射后2 h，显像剂在L2987肿瘤中的摄取[（2.41 ± 0.29）%ID/g]明显高于HT-29肿瘤中的摄取[（0.82 ± 0.11）%ID/g]。以上研究结果提示，18F-BMS-986192和放射性核素标记Atezolizumab有应用于肿瘤PD-L1靶向显像的潜能。
Niemeijer 等[20]将显像剂18F-BMS-986192和89Zr-Nivolumab用于进展期NSCLC患者接受Nivolumab治疗前的全身PET/CT显像，这是关于人体靶向PD-1/PD-L1显像的首次报道。结果显示，在不同患者及同一患者的不同肿瘤病灶之间，肿瘤对显像剂的摄取具有明显异质性。肿瘤对18F-BMS-986192的标准化摄取峰值（SUVpeak）与IHC检测的肿瘤PD-L1表达水平相关，89Zr-Nivolumab的摄取与肿瘤浸润免疫细胞PD-1的表达相关。
Bensch 等[21]用89Zr-Nivolumab对3种不同类型的肿瘤（膀胱癌、NSCLC、三阴性乳腺癌）患者（共22例）在接受PD-L1抑制剂治疗前后进行PET/CT显像，评估89Zr-Nivolumab PET/CT显像对PD-L1抑制剂治疗的预后价值。结果显示，不同肿瘤类型、不同病灶部位对显像剂的摄取有所不同，89Zr-Nivolumab PET/CT显像能够判断患者预后，以SUVmax≥9为临界值，治疗前肿瘤摄取89Zr-Nivolumab越高的患者无进展生存期和总生存期越长。
除PD-L1抗体之外，小分子多肽也可作为PD-L1显像的特异性靶点，小分子多肽具有血浆清除快、容易合成的特点，更适合临床应用。有研究显示，小分子WL12能够与PD-L1特异性结合。Chatterjee等[22]和Lesniak等[23]分别用64Cu和18F标记PD-L1结合多肽WL12，制成64Cu-WL12和18F-FPy-WL12。显像剂主要聚集在肿瘤、肝脏和肾脏。体内及体外实验都显示，未标记的多肽能够阻断肿瘤对显像剂的摄取，提示64Cu-WL12 和18F-FPy-WL12能够特异性靶向探测肿瘤PD-L1。
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SPECT显像具有检查设备应用广，显像成本相对较低、显像药物制作简易等优点。用于标记PD-1/PD-L1靶向显像剂的单光子核素包括111In（半衰期67.3 h）和99Tcm（半衰期6.02 h）。
Heskamp等[24]用111In标记靶向人PD-L1的鼠源性PD-L1单抗PD-L1.3.1（111In- DTPA-PD-L1.3.1），在不同PD-L1表达水平的乳腺癌荷瘤鼠模型上行SPECT/CT显像。111In- DTPA-PD-L1.3.1与不同乳腺癌细胞的结合率随PD-L1阳性率的升高而增加。注射显像剂后第3天和第7天显像效果较好，可能是由于PD-L1单抗在体内循环时间较长。111In- DTPA-PD-L1.3.1在PD-L1高表达的乳腺癌（MDA-MB-231和SK-Br-3）中聚集较多，在PD-L1低表达或不表达的乳腺癌（SUM-149、BT474、MCF-7）中低摄取或不摄取，与IHC的检查结果一致。SPECT/CT和放射自显影都显示111In- DTPA-PD-L1.3.1在肿瘤组织中的分布具有异质性，这是首个关于PD-L1的SPECT/CT显像研究。
Chatterjee等[18]用111In成功标记了人源化抗PD-L1单抗Atezolizumab（111In-PD-LI-mAb），体外细胞摄取实验和SPECT/CT显像都提示PD-L1高表达的肿瘤对111In-PD-LI-mAb的摄取明显高于PD-L1低表达的肿瘤。
单克隆抗体相对分子质量大，血液循环滞留时间长，需要用较长半衰期的核素进行标记，显像时间较长，一般注射显像剂24 h后才能进行显像，难以临床推广应用。纳米抗体相对分子量较低、组织穿透力强、可以与抗原快速特异性结合，游离的抗体能快速经肾脏代谢，可在几小时内获得高对比度的显像。
Xing等[25]用99Tcm标记抗PD-L1的单域纳米抗体NM-01制成SPECT/CT显像剂，用于进展期NSCLC患者体内PD-L1表达水平的监测，该显像剂具有良好的体内生物分布，注射后2 h得到的图像质量良好。原发病灶肿瘤对显像剂的摄取与IHC显示的PD-L1表达水平相关。全身SPECT/CT显像提示淋巴结和骨转移病灶也有显像剂99Tcm-NM-01摄取。这是首个用于人体的99Tcm标记抗PD-L1抗体研究，实现了SPECT/CT在活体内无创、全面显示肿瘤PD-L1表达的目的，弥补了穿刺活检技术不能反映全身PD-L1分布和转移病灶的缺陷。
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Chatterjee 等[18]将荧光染料Licor800联接的PD-L1单抗（NIR-PD-LA-mAb）用于检测不同乳腺癌细胞PD-L1表达的光学成像。在MDA-MB-231（PD-L1阳性肿瘤细胞占27%）肿瘤组织中的荧光信号明显高于SUM149（PD-L1阳性肿瘤细胞占0.1%），因此推测荧光探针NIR-PD-LA-mAb可用于PD-L1表达阳性的三阴性乳腺癌的光学成像。
Du等[26]用MRI显像剂Gd-DOTA和近红外荧光染料联合标记PD-L1单抗，合成MRI/荧光双模态纳米探针PD-L1-PCI-Gd。光学显像显示肿瘤组织中PD-L1靶向的纳米材料摄取明显高于非靶向材料。靶向PD-L1的肿瘤组织的荧光信号比本底高20%左右。MRI显示在肿瘤组织中的信号强度显著高于对照组。
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分子影像能够定量评估肿瘤组织及肿瘤浸润免疫细胞PD-L1/PD-1的表达，预测免疫治疗的反应效率，对肿瘤患者进行个体化精准治疗，避免对不能从免疫治疗中获益的患者产生不良反应。目前的研究尚存在以下问题：首先，用于探针标记的放射性核素64Cu、89Zr、111In来源有限，临床难以获得，迫切需要研发更多18F或99Tcm标记的PD-1/PD-L1靶向探针；其次，每一种分子影像都各有优缺点，可发挥多模态影像融合技术优势，更好地显示靶向PD-1/PD-L1的成像效果。今后还需要更多大规模的临床试验，推动PD-1/PD-L1靶向分子影像为肿瘤免疫治疗和评估提供更科学的依据，实现肿瘤免疫治疗的准确化、个体化和最优化。
利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。
作者贡献声明 邢岩负责文献查阅、论文撰写；赵晋华负责方法建立、论文审阅。
靶向免疫检查点PD-1/PD-L1的肿瘤分子影像学研究进展
Advances of molecular imaging of immune checkpoint targeting PD-1/PD-L1 in tumors
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摘要: 程序化细胞死亡受体-1（PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂通过阻断PD-1与PD-L1的结合使负向调控信号受阻，重新激活T淋巴细胞，增强免疫应答。临床试验结果显示PD-1/PD-L1抑制剂对多种肿瘤有明确的疗效，且疗效与肿瘤PD-1/PD-L1的表达水平相关。因此在免疫治疗之前检测患者PD-1/PD-L1的表达水平对筛选可能获益的患者、预测免疫治疗反应尤为重要。靶向PD-1/PD-L1的分子影像学方法能够在活体内无创、全面、准确地显示肿瘤PD-1及PD-L1的表达水平，成为国内外的研究热点。笔者对靶向PD-1/PD-L1肿瘤分子影像学的研究进展作一综述。
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关键词:
- 肿瘤 /
- 免疫治疗 /
- 程序化细胞死亡受体-1 /
- 程序化细胞死亡配体-1 /
- 分子影像
Abstract: Programmed cell death-1 (PD-1) and its ligand (PD-L1) inhibitors can inhibit the PD-1 and PD-L1 combination to block negative control signals. This condition leadings to the activity of T lymphocytes and the enhancement of immune responses. Clinical studies have shown that PD-1/PD-L1 inhibitors have a definite effect on a broad set of malignancies, but a substantial number of patients do not respond. Predicting the immunotherapy response by evaluating the expression of PD-1 and PD-L1 is urgently needed. Molecular imaging modalities, such as PET, SPECT, optical imaging, and MRI, can noninvasively and dynamically detect the overall expression of PD-1/PD-L1 in patients. They can help in selecting patients who are suitable for immunotherapy and monitor the tumor response. This review describes the current status and progress of molecular imaging targeting PD-1/PD-L1 in tumors.-
Key words:
- Neoplasms /
- Immunotherapy /
- Programmed cell death-1 /
- Programmed cell death ligand-1 /
- Molecular imaging
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