下载:
-
放射性肺纤维化（radiation-induced pulmnory fibrosis，RPF）是临床胸部肿瘤放疗常见的并发症之一，也可发生于骨髓移植手术前的放疗预处理及其他意外照射中。临床上对RPF缺乏特异、有效的治疗措施，患者预后较差[1]。因此如何减少RPF的发生、减轻RPF的程度已成为肿瘤放疗基础和临床研究的一个热点。
RPF的发生是多种效应细胞、细胞因子及炎性介质综合作用的结果[2-4]，其中，转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是最重要的参与因子之一[5]。在哺乳动物中，TGF-β主要有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3种亚型[6]，其中TGF-β1是已知的最重要的致纤维化因子之一[7]。笔者所在军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所实验室前期研究结果表明TGF-β3具有拮抗RPF的作用[8]，但具体的作用机制目前还不清楚。业已证实上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺纤维化的重要机制之一[9]，笔者利用60Co γ射线胸部照射诱发小鼠RPF模型，探索TGF-β3在小鼠RPF发生过程中的作用机制。
-
选取辐射敏感的雌性C57BL/6小鼠建立RPF动物模型[8-11]。清洁级雌性C57BL/6小鼠180只，体重（20±2）g，购自北京维通利华生物科技有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2012>0001]，完全随机分为对照组、单纯照射组（简称照射组）和照射+TGF-β3组（简称TGF-β3组）。照射组和TGF-β3组小鼠在军事科学院军事医学研究院钴源室进行单次60Co γ射线胸部照射，照射剂量20 Gy [10]，照射前小鼠用戊巴比妥钠（德国Merck公司）腹腔注射麻醉，通过固定四肢固定在木板上，与升起的钴源摆放在同一高度，两者间距3 m（剂量率为215 cGy/min），除胸部照射部位3 cm×1.5 cm区域外，其余部位用10 cm厚铅砖完全屏蔽。照射组和TGF-β3组每周1次分别腹腔注射0.9%生理盐水和TGF-β3（1 μg/kg）各0.5 mL，对照组不予处理。分别于照射后的1、3和6个月处死小鼠取材。
-
重组人TGF-β3（美国Peprotech公司）；胶原检测试剂盒（英国Biocolor公司）；紧密连接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）抗体、N-钙粘蛋白（N-cadherin）抗体（英国Abcam公司）；山羊抗兔IgG/HRP聚合物（HRP：辣根过氧化物酶）、二氨基联苯胺（DAB）显色液、苏木素（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
-
小鼠活杀后迅速取出肺脏，经生理盐水漂洗后，用4%中性甲醛溶液固定，常规病理组织切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色和Masson三色染色，观察肺组织病理和胶原蛋白的表达情况。其中对肺纤维化的程度按无肺间质纤维化（-）、轻度肺间质纤维化（+，病变范围局限在全肺20%以下）、中度肺间质纤维化（++，病变范围占全肺20%~50%）、重度肺间质纤维化（+++，病变范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱）进行分级，分别计0分、1分、2分、3分，进行半定量统计分析[12]。用胶原检测试剂盒检测右肺组织胶原蛋白含量。
-
采用免疫组化法观察上皮标志物ZO-1和间质标志物N-cadherin在肺组织中的表达情况。每张切片观察1000个细胞，计数阳性细胞数。另完全随机选择5个视野，用Image Pro Plus 5.1软件分析每个视野中阳性表达的积分光密度（integrated optical density，IOD）。
-
采用Stata 10软件进行数据统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。用两因素一元定量资料方差分析分析数据，方差齐性的数据采用ANOVA检验，方差不齐的数据采用Mann-Whitney U秩和检验；定性资料用χ2检验和Fisher确切概率法进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
-
小鼠照射后肺组织病理改变及纤维化程度分析统计结果见图 1。对照组小鼠肺泡壁无增厚，肺组织结构大致正常。照射后1个月，照射组小鼠肺组织可见炎症细胞浸润，部分肺泡腔融合扩大，部分肺泡壁增厚，与对照组相比，差异有统计学意义（Z=-2.882，P<0.05）；TGF-β3组虽有炎症细胞浸润及少数肺泡腔融合扩大，明显轻于对照组，但差异无统计学意义（Z=-1.845，P>0.05）。照射后3个月，照射组肺泡结构进一步破坏，肺泡壁进一步增厚，与对照组相比，差异有统计学意义（Z=-2.887，P<0.05）；TGF-β3组仍以炎症细胞浸润为主，部分肺泡腔融合扩大，与照射组相比，差异有统计学意义（Z=-2.562，P<0.05）。照射后6个月，照射组肺组织结构紊乱，肺泡壁明显增厚，大量肺泡萎陷，可见明显的纤维化病灶形成，与对照组相比，差异有统计学意义（Z=-2.903，P<0.05）；而TGF-β3组虽然局部肺泡萎陷，肺泡壁增厚，但大体肺泡完整，与照射组相比明显减轻，差异有统计学意义（Z=-2.807，P<0.05）。
图 1 照射后不同时间小鼠肺组织纤维化病变结果
Figure 1. Pulmonary fibrosis lesion of mice at different time after irradiation
-
小鼠照射后Masson三色染色分析肺组织胶原沉积结果见图 2。照射后1个月，照射组肺组织可见少量蓝染的胶原纤维，照射后3和6个月，可见大量蓝染的胶原纤维弥散至整个肺部；而相应的TGF-β3组蓝染的胶原纤维明显减少（图 2中A）。与对照组比较，照射小鼠（照射组和TGF-β3组）经照射1、3、6个月后，肺组织胶原蛋白表达量显著增高，差异有统计学意义（Z=-2.713、-2.600、-2.737、-2.591、-2.434、-2.236，均P<0.05），而与照射组相比，TGF-β3组小鼠照射后3和6个月肺组织胶原表达量明显减少，差异有统计学意义（Z=2.442、2.529，均P<0.05），这表明TGF-β3对辐射诱发小鼠肺纤维化有拮抗作用（图 2中B）。
图 2 照射后不同时间小鼠肺组织胶原蛋白沉积结果
Figure 2. The deposition of collagen in lung tissues of mice at different time after irradiation
-
小鼠照射后肺组织中上皮细胞特征分子标志物ZO-1和间质细胞特征分子标志物N-cadherin的免疫组化及分析结果见图 3。其中，肺组织ZO-1阳性细胞率及其表达水平的IOD检测结果见图 3中B、C，N-cadherin阳性细胞率及其表达水平的IOD检测结果见图 3中E、F。从图示可以看出，与对照组比较，照射后1、3和6个月，照射组和TGF-β3组肺组织ZO-1阳性细胞率（P<0.05）与表达水平（Z=4.492、2.784，5.831、3.425，6.064、4.511，均P<0.05）均显著降低，差异有统计学意义，而N-cadherin阳性细胞率（P<0.05）及表达水平（Z=3.269、-3.095，-5.520、-5.423，-6.063、-5.675，均P<0.05）均显著增高，差异有统计学意义，并呈现良好的时间效应关系，这表明随着RPF发生、发展，EMT也显著增高。而与照射组相比，TGF-β3组ZO-1阳性细胞率（P<0.05）及表达水平（Z=-2.881、-4.220、-5.695，均P<0.05）均明显增高，差异有统计学意义，N-cadherin阳性细胞率（P<0.05）和表达水平（Z=4.546、3.560、4.919，均P<0.05）均明显减少，差异有统计学意义，这表明TGF-β3组EMT发生率显著低于照射组。提示TGF-β3对RPF的拮抗作用与其抑制EMT的发生有关。
图 3 60Co γ射线胸部照射诱发小鼠肺组织EMT检测结果
Figure 3. Immunohistochemistry results of epithelial-mesenchymal transition features in irradiated mice with and without the treatment of transforming growth factor-β3
-
RPF的病理改变主要为肺组织中结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致肺结构破坏和功能减退[11-14]。肺纤维化发生最主要的效应细胞是肺成纤维细胞和（或）肌成纤维细胞。其来源主要有3种：（1）肺内损伤部位或周边原位的成纤维细胞和（或）肌成纤维细胞的增殖分化；（2）外周血循环池中骨髓来源的循环纤维细胞通过特定的趋化因子的作用迁移至损伤部位并分化为成纤维细胞和（或）肌成纤维细胞；（3）EMT这部分细胞来源约占所有效应细胞的30%以上[15]。
目前已有研究结果表明，60Co γ射线照射小鼠胸部后会诱导小鼠肺发生RPF，并且小鼠肺组织中的上皮细胞也会发生EMT[16]；EMT定义为细胞逐步丧失上皮细胞标志物，同时逐步获得间质细胞标志物的过程，上皮细胞标志物包括E-cadherin、ZO-1等，而间质细胞标志物包括N-cadherin、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin）等[17]。也有文献报道TGF-β3可部分拮抗60Co γ射线诱导的小鼠肺发生的RPF[18]。
然而，TGF-β3是否通过EMT途径拮抗RPF目前尚不清楚，为了弄清楚这个问题，我们用60Co γ射线照射C57BL/6小鼠胸部建立RPF动物模型，同时给予TGF-β3干预，结果表明，经照射后，小鼠肺部出现了肺泡壁增厚、肺泡腔融合和胶原纤维沉积增多等典型的纤维化病理改变，这说明我们已成功建立了辐射诱导的RPF的动物模型，给予TGF-β3干预后，小鼠肺的病理变化和胶原蛋白的沉积情况均较单纯照射后的小鼠轻微，这说明TGF-β3可拮抗辐射诱导的RPF的发生，这与已有的文献结果一致[15]。同时，我们用免疫组织化学法也检测了小鼠肺组织中EMT的表达情况，发现与对照组相比，经照射和照射并给予TGF-β3干预后，小鼠肺组织上皮细胞明显发生了EMT，但与单纯照射相比，经TGF-β3干预后，小鼠肺组织上皮细胞EMT的发生强度明显减弱。
综上所述，我们的实验结果表明了TGF-β3可能通过EMT途径减轻或延缓RPF的发生，我们提出了从EMT方面着手来探索TGF-β3拮抗RPF的机制并探索了二者之间的关系，为进一步研究TGF-β3拮抗RPF的具体的信号转导机制及为临床RPF的预防和治疗提供了新的线索。
TGF-β3通过抑制上皮间质转化拮抗放射性肺纤维化
TGF-β3-ameliorated radiation-induced pulmonary fibrosis by inhibiting epithelial-mesenchymal transition
-
摘要:
目的检测分析放射性肺纤维化过程中上皮间质转化（EMT）情况，探索转化生长因子β3（TGF-β3）是否通过EMT途径抑制放射性肺纤维化的发生。 方法将180只C57BL/6雌性小鼠按体重完全随机分为对照组、单纯照射组（简称照射组）和照射+TGF-β3组（简称TGF-β3组），照射组和TGF-β3组经20 Gy 60Co γ射线单次胸部照射后，分别腹腔注射0.5 mL 0.9%的生理盐水和TGF-β3（1 μg/kg），每周1次，于照射后1、3和6个月活杀，用苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色后观察肺组织病理学改变，用免疫组化法检测肺组织EMT相关的上皮标志物紧密连接蛋白（ZO-1）和间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）的表达，用Mann-Whitney U秩和检验和Fisher确切概率法对结果进行统计分析。 结果HE和Masson染色结果显示，照射能够引起小鼠肺泡壁增厚、肺泡间隔明显增宽、肺泡结构严重破坏、胶原纤维大量沉积等典型纤维化病理改变；照射后3和6个月，与照射组比较，TGF-β3组小鼠肺纤维化病变明显减轻，差异有统计学意义（Z=-2.562、-2.807，均P<0.05），胶原沉积显著减少，差异有统计学意义（Z=2.442、2.529，均P<0.05）。免疫组化结果显示，与对照组比较，照射后1、3和6个月，小鼠肺组织ZO-1的表达量明显减少，差异有统计学意义（Z=4.492、5.831、6.064，均P<0.05），N-cadherin的表达量显著增高，差异有统计学意义（Z=-3.269、-5.520、-6.063，均P<0.05）；与照射组比较，TGF-β3组ZO-1表达量显著增高，差异有统计学意义（Z=-2.881、-4.220、-5.695，均P<0.05），而N-cadherin表达量显著减少，差异有统计学意义（Z=4.546、3.560、4.919，均P<0.05）。 结论TGF-β3可通过抑制EMT拮抗放射性肺纤维化。 Abstract:ObjectiveTo detect and analyze the influence of epithelial-mesenchymal transition (EMT) on radiation-induced pulmonary fibrosis and explore whether the anti-fibrosis effect of transforming growth factor-β3 (TGF-β3) is mediated by EMT. MethodsC57BL/6 female mice were randomly divided into three groups:control group, irradiation group only (irradiated group), and irradiation and TGF-β3 group (TGF-β3 group). The irradiation group received intraperitoneal injections of 0.5 ml saline, and the TGF-β3 group received intraperitoneal injections of 1 μg/kg human recombinant TGF-β3 every week after single dose of 20 Gy irradiation to their thoraxes. The mice in each group were sacrificed for 1, 3, and 6 months after irradiation. The mouse lung pathological changes were evaluated by hematoxylin-eosin and Masson trichrome. The expression of EMT epithelium-marked protein zonula occludens-1(ZO-1) and interstitial-marked protei N-cadherin were measured by immunohistochemistry. The results were analyzed using Mann-Whitney U test and Fisher's exact probability. ResultsAlveolar walls thickened, collagen fibers were deposited, and other typical fibrosis changed after irradiation. Unlike those in the irradiation group, pulmonary fibrosis lesions were significantly reduced (Z=-2.562, -2.807, both P<0.05) and collagen deposition was obviously decreased (Z=2.442, 2.529, both P<0.05) in the TGF-β3 group. The expression of ZO-1 was markedly decreased (Z=4.492, 5.831, 6.064, all P<0.05) and the expression of N-cadherin was significantly increased (Z=-3.269, -5.520, -6.063, all P<0.05) in the lung tissues of mice at 1, 3, and 6 months after irradiation. Unlike the irradiation group, the expression of ZO-1 was increased (Z=-2.881, -4.220, -5.695, all P<0.05) and the expression of N-cadherin was decreased (Z=4.546, 3.560, 4.919, all P<0.05) in the TGF-β3 group. The differences were significant. ConclusionTGF-β3 may antagonize radiation-induced pulmonary fibrosis by inhibiting EMT. -
图 1 照射后不同时间小鼠肺组织纤维化病变结果
Figure 1. Pulmonary fibrosis lesion of mice at different time after irradiation
图 2 照射后不同时间小鼠肺组织胶原蛋白沉积结果
Figure 2. The deposition of collagen in lung tissues of mice at different time after irradiation
-
[1] Straub JM, New J, Hamilton CD, et al. Radiation-induced fibrosis:mechanisms and implications for therapy[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2015, 141(11):1985-1994. DOI:10.1007/s00432-015-1974-6. [2] 郑啓盛, 刘培勋.放射性肺纤维化的分子机制及其防治药物综述[J].辐射研究与辐射工艺学报, 2016, 34(1):1-10. DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010101.
Zheng QS, Liu PX. Review on molecular mechanisms and protective drugs research on radiation-induced lung fibrosis[J]. J Radiat Res Radiat Process, 2016, 34(1):1-10. doi: 10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010101[3] 朱玉凤.肺纤维化细胞因子机制研究进展[J].当代医药论丛, 2015, 13(5):157-157, 158.
Zhu YF. Progress of cytokine mechanism in pulmonary fibrosis[J]. Contemporary Med Forum, 2015, 13(5):157-157, 158.[4] 王司仪, 原铭贞, 刘笑玎, 等.细胞因子与肺纤维化相关性的研究进展[J].吉林大学学报(医学版), 2014, 40(6):1325-1329. DOI:10.13481/j.1671-587x.20140641.
Wang SY, Yuan MZ, Liu XD, et al. Advance research on relationship between cytokines and pulmonary fibrosis[J]. J Jilin Univ Med Edit, 2014, 40(6):1325-1329. doi: 10.13481/j.1671-587x.20140641[5] Leask A, Abraham DJ. TGF-beta signaling and the fibrotic response[J]. FASEB J, 2004, 18(7):816-827. DOI:10.1096/fj.03-1273rev. [6] Hall BE, Wankhade UD, Konkel JE, et al. Transforming growth factor-β3(TGF-β3) knock-in ameliorates inflammation due to TGF-β1 deficiency while promoting glucose tolerance[J]. J Biol Chem, 2013, 288(44):32074-32092. DOI:10.1074/jbc.M113. 480764. [7] Ask K, Bonniaud P, Maass K, et al. Progressive pulmonary fibrosis is mediated by TGF-β isoform 1 but not TGF-β3[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(3):484-495. DOI:10.1016/j.biocel.2007. 08. 016. [8] Xu L, Xiong S, Guo R, et al. Transforming growth factor β3 attenuates the development of radiation-induced pulmonary fibrosis in mice by decreasing fibrocyte recruitment and regulating IFN-γ/IL-4 balance[J]. Immunol Lett, 2014, 162(1 Pt A):27-33.DOI:10.1016/j.imlet.2014.06.010.
[9] Horowitz JC, Thannickal VJ. Epithelial-mesenchymal interactions in pulmonary fibrosis[J]. Semin Respir Crit Care Med, 2006, 27(6):600-612. DOI:10.1055/s-2006-957332. [10] 杜雪梅, 柳晓兰, 崔玉芳, 等.放射性肺损伤小鼠动物模型的建立及其病变规律[J].中国体视学与图像分析, 2003, 8(4):203-206. DOI:10.3969/j.issn.1007-1482.2003.04.003.
Du XM, Liu XL, Cui YF, et al. ESTABLISHMENT OF IRRADIA-TION-INDUCED LUNG INJURY MOUSE MODEL AND ITS PATHOLOGICAL CHANGES REGULARITY[J]. CHIN J STERE-OL IMAGE ANALYSIS, 2003, 8(4):203-206. doi: 10.3969/j.issn.1007-1482.2003.04.003[11] 杨燕光, 王金云, 张珏, 等.局部晚期非小细胞肺癌调强放疗与三维适形放疗的剂量学及临床疗效分析[J].中国肿瘤, 2014, 23(10):873-877. DOI:10.11735/j.issn.1004-0242.2014.10.A017.
Yang YG, Wang JY, Zhang J, et al. An Analysis of Dosimetric and Clinical Effect of Intensity Modulated Radiotherapy and Three-dimensional Conformal Radiotherapy for Locally Advanced Non-small Cell Lung Cancer[J]. China Cancer, 2014, 23(10):873-877. doi: 10.11735/j.issn.1004-0242.2014.10.A017[12] Xiong SS, Guo RF, Yang ZH, et al. Regulatory T Cells Promote β-Catenin-Mediated Epithelium-to-Mesenchyme Transition During Radiation-Induced Pulmonary Fibrosis[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2015, 93(2):425-435. DOI:10.1016/j.ijrobp.2015.05.043. [13] 陈忠杰, 王莉, 方银善, 等.放射线剂量和剂量率对小鼠肺纤维化的影响[J].中华结核和呼吸杂志, 2016, 39(2):117-121. DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2016.02.010.
Chen ZJ, Wang L, Fang YS, et al. Effect of radiation dose and dose rate on pulmonary fibrosis in mice[J]. Chin J Tubere Respir Dis, 2016, 39(2):117-121. doi: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2016.02.010[14] 赵利强. 沙百润肺颗粒干预大鼠放射性肺纤维化的实验研究[D]. 太原: 山西省中医药研究院, 2016: 1-46.
Zhao LQ. The experimental study of Shabai Moistening Lung particles intervening in radiation-induced pulmonary fibrosis in rats[D]. Taiyuan: Shanxi Traditional Chinese Medicine Institute, 2016: 1-46.[15] Reilkoff RA, Bucala R, Herzog EL. Fibrocytes:emerging effector cells in chronic inflammation[J]. Nat Rev Immunol, 2011, 11(6):427-435. DOI:10.1038/nri2990. [16] 熊珊珊. 调节性T淋巴细胞在放射性肺纤维化中的作用及机制研究[D]. 北京: 军事医学科学院, 2015: 1-135.
Xiong SS. The roles and mechanisms of Regulatory T cells (Tregs) in radiation-induced pulmonary fibrosis[D]. Beijing: Academy of Military Medical Sciences, 2015: 1-135.[17] Hay ED. The mesenchymal cell, its role in the embryo, and the remarkable signaling mechanisms that create it[J]. Dev Dyn, 2005, 233(3):706-720. DOI:10.1002/dvdy.20345. [18] 徐龙. 转化生长因子-β3调控循环纤维细胞在放射性肺纤维化中的作用研究[D]. 北京: 军事医学科学院, 2015: 1-101.
Xu L. Study on the role of transforming growth factor-β3 by regulating fibrocytes in radiation-induced pulmonary fibrosis[D]. Beijing: Academy of Military Medical Sciences, 2015: 1-101. -
点击查看大图
图(3)
计量
- 文章访问数: 3331
- HTML全文浏览量: 1998
- PDF下载量: 2