MTT、聚偏氟乙烯膜、Lipofectamine 3000、Opti-MEM、Real-Time PCR试剂盒均购自美国赛默飞世尔科技有限公司；二甲基亚砜购自美国Sigma公司；姬姆萨染色液（G8220-10 g）购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗人B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，BCL2）抗体购自美国Proteintech公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体及山羊抗兔或小鼠IgG购自英国Abcam公司；lncRNA NBR2及pcDNA-BCL2过表达载体由深圳华大基因科技有限公司合成；¹³⁷Cs γ射线照射源购自加拿大原子能有限公司（Autocell40）；ChemiDoc MP凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司；RT-6500酶标分析仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。

人类乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞购自美国ATCC细胞库，采用含10%胎牛血清的1640培养液，于含5% CO₂的37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至密度约为80%时进行传代亚培养。选择处于对数生长期的肿瘤细胞进行实验。根据处理方法的不同，分别按以下方式进行分组。（1）把乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分为3组：空白对照组、4 Gy γ射线照射组和8 Gy γ射线照射组，采用实时定量PCR检测lncRNA NBR2的表达；（2）把乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分为4组：空白对照组、NBR2转染组、4 Gy γ射线照射组和NBR2转染+γ射线照射联合组，采用MTT方法来检测细胞增殖情况；（3）将乳腺癌MCF-7细胞分为2组：空白对照组和NBR2转染组，采用实时定量PCR检测靶基因的表达；（4）将乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞分为3组：空白对照组、NBR2 0.5 μg转染组和NBR2 1.0 μg转染组，采用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达水平变化；（5）把乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分为3组：空白对照组、NBR2单独转染组和NBR2+BCL2共转染组，对3组细胞进行不同剂量的γ射线照射，并采用MTT和克隆形成实验方法检测细胞生长情况。采用¹³⁷Cs γ射线照射源进行照射，照射剂量为2、4和8 Gy，剂量率为1 Gy/min。

转染前1 d，将细胞接种于六孔板中，每孔加入约2 mL无抗生素培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%。取2 μL/孔Lipofectamine 3000与50 μL/孔Opti-MEM混匀后室温下孵育5 min；取0.5 μg/孔NBR2或pcDNA-BCL2过表达载体与50 μL/孔Opti-MEM混匀后室温下孵育5 min。将以上2步所得溶液混匀，室温下放置30 min，即为转染液。将转染液加入含有细胞及培养液的孔中，轻轻摇晃孔板，使混合均匀，在37℃的CO₂培养箱中培养6 h后将培养基换成含血清的完全培养基。

取对数生长期MCF-7和MDA-MB-231细胞，调整细胞浓度为1.0×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中，然后进行细胞转染和（或）γ射线照射，处理后48 h弃去培养基，每孔中加入20 μL MTT，继续培养4 h。加入120 μL二甲基亚砜并振摇10 min。采用酶标分析仪检测细胞在490 nm波长下的光密度值，以A490（A为吸光度）值代表细胞活力。以未作任何处理的细胞作为空白对照组，其细胞存活率为100%，其余各实验组按存活率=（实验组吸光度值/空白对照组吸光度值）×100%进行计算。

乳腺癌细胞接受瞬时转染及不同剂量照射后，按不同的照射剂量接种不同数量的细胞至60 mm培养皿中。细胞连续培养2周后用甲醇固定，姬姆萨染液染色，计数细胞数≥50个的克隆个数。计算克隆形成率和存活分数，其中，克隆形成率=（空白对照组克隆数/实验组细胞数）×100%，存活分数=空白对照组克隆数/（实验组细胞数×克隆形成率），并按多靶单击模型拟合绘制细胞存活曲线。

收集瞬时转染并接受γ射线照射后的细胞，用细胞裂解液冰上裂解，提取总蛋白，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量。取各组等量蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭后，分别加入兔抗人BCL2抗体（1 : 2000稀释），以小鼠抗人GAPDH（1 : 6000稀释）作为内参抗体，4℃孵育过夜。次日洗膜，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或小鼠IgG（1 : 5000稀释），室温下孵育1 h，洗膜后显色，用凝胶成像系统采集成像。

收集细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，反转录获得cDNA，检测NBR2和BCL2 mRNA的表达，同时检测GAPDH mRNA的表达作为内参。PCR扩增条件为: 95℃预变性30 s；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次。数据采用2－^ΔΔCt法进行分析。

GAPDH引物序列：

正向5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3’;

反向5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG3’;

LncRNA NBR2引物序列：

正向5’-CTT CCA GTT GCG GCT TAT-3’;

反向5’-ATC TTC CTC ATC CAG GTA TT-3’

BCL2引物序列：

正向5’-TGG TCC ACC TGA CCC TC-3’;

反向5’-CCC ACC GAA CTC AAA GAA-3’

另外，由于NBR2可以通过激活AMPK进而发挥功能，因此，我们将AMPK的基因芯片与照射后变化的基因进行了对比分析。BCL2在乳腺或乳腺癌组织中的表达情况，由数据库（https://www.oncomine.org/resource/login.html）分析获得。

应用IBM SPSS Statistics 21软件进行统计学分析。原始数据均服从正态分布和方差齐性，采用t检验比较组间差异，分析方法为Student t-test。P<0.05表示差异有统计学意义。

实时定量PCR结果（图 1中A、B）显示，与空白对照组相比，γ射线（4 Gy或8 Gy）照射能够下调乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中NBR2 mRNA的表达水平，差异有统计学意义（MCF-7：t=10.75、11.17，MDA-MB-231：t=11.22、12.31，均P<0.01）。MTT实验结果（图 1中C、D）显示，与空白对照组相比，虽然单纯的γ射线（4 Gy）或NBR2转染都抑制了乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的生长，但差异无统计学意义；与4 Gy γ射线照射组相比，NBR2转染+γ射线照射联合组可以明显抑制乳腺癌细胞的生长，且生长程度的差异有统计学意义（24、48、72 h）（MCF-7：t=9.96、10.34、10.55，MDA-MB-231：t=10.28、10.79、11.97，均P<0.01）。以上实验结果表明，通过lncRNA NBR2转染提高NBR2的表达能有效提高乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞对γ射线的放射敏感性。

图  1  实时定量PCR和MTT实验检测NBR2表达水平与酌射线照射以及乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞生长之间的关系

Figure 1.  Relationship between NBR2 expression level, 4 Gy γ ray irradiation, and breast cancer MCF-7, MDA-MB-231 cells growth was detected by qRT-PCR analysis and MTT assays

AMPK的基因芯片（775个基因）与照射后变化的基因（248个基因）的对比结果显示，有5个基因[BCL2、细胞分裂周期蛋白25A（CDC25A）、肿瘤易感性候选蛋白1（CASC1）、活化T细胞2蛋白相互作用核因子蛋白（NFATC2IP）、胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白1（CPEB1）]能够同时被调控。实时定量PCR结果进一步显示，与空白对照组相比，NBR2过表达确实能够对这5个基因的mRNA水平产生一定的下调作用，且BCL2的下调水平最为明显（t=12.13，P<0.01）（图 2中A）。此外，数据库分析结果显示，BCL2在浸润性乳腺癌中的表达水平显著高于正常乳腺组织（图 2中B）；同时，BCL2在不同类型的乳腺癌组织中均存在不同程度的表达（图 2中C）。这些实验结果表明，NBR2在乳腺癌MCF-7细胞中能够下调BCL2的表达水平，且BCL2可以作为NBR2发挥增敏作用的潜在靶点。

图  2  NBR2对BCL2 mRNA表达水平的影响以及BCL2在乳腺或乳腺癌组织中的表达水平分析

Figure 2.  Effect of NBR2 on the mRNA level of BCL2 (A) and analysis of BCL2 expression in breast or breast cancer tissues (B, C)

与空白对照组相比，NBR2过表达可以下调乳腺癌MCF-7细胞中BCL2的mRNA及蛋白表达水平（图 3中A）；同时，与空白对照组相比，NBR2过表达也可以下调乳腺癌MDA-MB-231细胞中BCL2的mRNA及蛋白表达水平（图 3中B）。这些实验结果表明，NBR2能够在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中抑制BCL2的mRNA及蛋白表达水平。

图  3  NBR2对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中BCL2 mRNA及蛋白表达水平的影响

Figure 3.  Effect of NBR2 on the expression of BCL2 at the mRNA and protein levels in MCF-7(A) and MDA-MB-231 (B) cells

MTT实验结果（图 4中A、B）显示，与空白对照组相比，NBR2单独转染明显提高了乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的放射敏感性，且差异有统计学意义（t=12.36、11.95，均P<0.01）；而共转染了NBR2和BCL2的乳腺癌细胞则出现了辐射抵抗。另外，克隆形成实验结果（图 4中C、D）显示，与空白对照组相比，NBR2单独转染能够显著提高乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的放射敏感性，且差异有统计学意义（t=12.89、12.22，均P<0.01）；而共转染了NBR2和BCL2的乳腺癌细胞的放射敏感性则明显下降，且差异有统计学意义（t=10.87、11.37，均P<0.01）。这些结果表明NBR2可以通过抑制BCL2的表达水平进而增强乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的放射敏感性。

图  4  MTT实验和克隆形成实验检测NBR2和BCL2共转染对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞放射敏感性的影响

Figure 4.  Effects of NBR2 and pcDNA -BCL2 co -transfection on the radiosensitivity of breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cells were detected by MTT (A, B) and clonogenic (C, D) assay

乳腺癌是全球范围内女性最为高发的恶性肿瘤，其表现为高转移率、高致死率以及预后差^[17-18]。乳腺癌的多诱因性增加了临床上对乳腺癌诊断以及治疗的难度，也使乳腺癌的个体化治疗成为发展的必然趋势。辅助外科手术的放疗是治疗原位以及浸润性乳腺癌的常用手段^[19]。我国大约有70%的肿瘤患者需要综合放疗或单纯放疗的手段治疗癌症^[20-21]。但是，临床以及流行病学研究结果显示，不少的乳腺癌患者表现出明显的辐射抵抗，放疗的效果不佳，严重影响了乳腺癌的治疗以及预后^{[10, 21]}。然而迄今为止，其中的具体机制尚不清楚。

最近有研究结果表明，lncRNA NBR2作为一个重要的非编码RNA，其在乳腺肿瘤的抑制过程中发挥着重要作用^[15]。该研究还揭示了NBR2的缺失或表达水平的降低会导致细胞周期紊乱，进而促进体内肿瘤的生长^[15]。同时，NBR2在多种癌细胞或肿瘤组织中的表达水平均有显著降低^[14]。进一步的研究结果表明，NBR2可以通过各种应激作用而被诱导表达，同时在外界能量刺激下与AMPK相互作用，最终抑制肿瘤的发生发展^[16]。

在本研究中，我们探究了通过lncRNA NBR2转染人为升高NBR2的表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞放射敏感性的影响，结果发现NBR2确实可以明显提高乳腺癌细胞的放射敏感性，而且放射敏感性的提高伴随着细胞凋亡蛋白BCL2的表达水平的明显降低，揭示了NBR2的增敏作用可能与其调节细胞的凋亡通路相关蛋白有关。

BCL2是抗凋亡基因家族Bcl2中的一员，其通过抑制多种DNA修复而具有致癌活性，并可抑制癌细胞凋亡^[23-24]。同时，BCL2作为控制细胞凋亡的最终调节者，在多种肿瘤中高表达，包括乳腺癌^[25-26]。其表达水平上调的机制很复杂，雌激素、表皮生长因子受体等多种因素均可能参与其中^[27-29]。有研究结果表明，抑制BCL2基因或蛋白可增加乳腺癌细胞的凋亡，并逆转癌细胞对放化疗的耐受性，提高乳腺癌患者的放化疗疗效，改善患者预后^[30-32]。本研究结果显示，γ射线照射可以下调lncRNA NBR2的表达水平，但是过表达NBR2明显增强了乳腺癌细胞的放射敏感性，同时抑制了BCL2的表达水平，这一结果提示γ射线照射是通过下调NBR2的表达水平进而增强BCL2的表达，最终引发辐射抵抗，即：辐照→NBR2↓→BCL2↑→放射敏感性↓。本研究结果同时揭示了NBR2所介导的放射敏感性的提高是通过影响BCL2表达水平进而调控相关的凋亡信号通路来完成的。这一结论也在NBR2和pcDNA-BCL2共转染细胞的生存实验中得以验证，即提高BCL2的表达水平可以抑制NBR2的放射增敏效应。

总之，笔者发现人为地提高NBR2的表达水平能够增强乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的放射敏感性，而这种作用是通过抑制BCL2的表达水平及其信号通路来完成的。因此，深入研究lncRNA NBR2作为乳腺癌放疗敏感性调控的新靶点具有非常重要的临床意义和价值。本研究为乳腺癌的放疗增敏提供了新的实验依据和治疗策略，也为临床乳腺癌放疗疗效的提高奠定了基础。