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卵巢是女性最为重要的内分泌器官，同时也是对射线最为敏感的器官之一。肿瘤放疗所导致的卵巢功能早衰严重影响患者放疗后的生存质量[1]。如何在肿瘤放疗的同时尽可能地保护患者的卵巢功能，成为一个亟待解决的问题。近年来，有研究表明，在乳腺癌等肿瘤的患者化疗中，化疗前给予促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa）诱导卵巢休眠能够显著减少化疗药物对卵巢功能的损害[2-5]。而对于其能否对放疗所导致的卵巢功能损伤具有保护作用，目前国内外相关研究甚少。本研究拟采用大鼠动物模型，通过在盆腔放疗前给予GnRHa，观察GnRHa能否对放疗辐射所致卵巢功能损伤起到保护作用，并对可能的防护机制展开研究。
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Fischer 344雌性大鼠60只，鼠龄10周，购自北京维通利华实验动物中心，饲养于无特殊病原体级动物房，人工控制光照周期（12 h明、12 h暗）、温度（25℃±2℃）及相对湿度（55％~65％），自由采食全价鼠饲料及清洁水。每日于08 ∶ 00 ∶ 00以细棉签刮取大鼠阴道分泌物，载玻片涂片，光镜下观察阴道分泌物特点并判断其所处动情周期（表 1）。选用有正常动情周期的动物进入实验。
动情周期 阴道分泌物特点 动情前期 膨大及呈椭圆形的有核上皮细胞占主体，偶见角化上皮细胞及散在白细胞 动情期 外形不规则的大量角化上皮细胞堆积成团，少量白细胞 动情后期 不规则的角化上皮细胞、有核上皮细胞及白细胞，三者比例接近 动情间期 细胞数稀少，主要为白细胞及黏液 表 1 大鼠动情周期判断标准
Table 1. Criterion for determination of estrous cycle in rats
GnRHa醋酸戈舍瑞林注射液（Goserelin）购自阿斯利康药业（中国）有限公司。大鼠卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、雌二醇（estradiol，E2）酶联免疫分析试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司。大鼠抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）酶联免疫分析试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。Tunnel凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。兔抗大鼠CD31单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。IMMULITE 1000酶免分析仪购自德国Siemens公司；CLINAC-600C/D医用直线加速器购自美国VARIAN公司。
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取雌性Fischer 344大鼠5只，于动情间期皮下一次性注射GnRHa 0.25 mg后，连续经尾静脉取血，动态观察其血清中FSH、E2及AMH水平变化情况，为后续盆腔放疗时间点的选取提供实验依据。
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取Fischer 344雌性大鼠40只，用随机数字表法分为对照组、GnRHa组、放疗组（R组）及GnRHa+R组，每组10只，分别按表 2中的方案给予相应处理。盆腔照射后20 d处死大鼠，比较各组间的体重、卵巢湿重、血清FSH、E2、AMH水平的差异；对比各组大鼠卵巢内各发育阶段的卵泡数量。采用Tunnel染色和CD31染色检测各组大鼠卵巢中细胞凋亡指数和微血管密度（microvessel density，MVD）。
治疗分组 处理方案 对照组 第一天生理盐水100μl皮下注射 GnRHa组 第一天GnRHa 0.25mg皮下注射 放疗组（R组） 第一天生理盐水100μl皮下注射，第16天给予盆腔200cGy照射一次 GnRHa+R组 第一天GnRHa 0.25mg皮下注射, 第16天给予盆腔200cGy照射一次 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂。 表 2 大鼠分组与对应处理方案
Table 2. Grouping and corresponding treatment schemes
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在动情间期，采用剪尾采血法采血：动物麻醉后，将尾尖剪去约5 mm，从尾部向尾尖部按摩，让血液自行流出。每次采血约0.5 mL，低温放置2 h后3000 r/min离心10 min（离心半径5 cm）后提取血清。采用酶联免疫吸附试验法分别测定大鼠血清中FSH、E2及AMH水平。治疗结束时，处死大鼠后切取双侧卵巢，分析天平称取湿重，石蜡包埋处理后行苏木精-伊红染色。5 μm连续切片后取卵巢最大横切面，光镜下随机选取5个标准视野，参考相关文献标准计数各类卵泡总数[6]。Tunnel凋亡染色和CD31血管内皮免疫组化染色检测参考对应试剂公司提供的说明书进行，凋亡指数及MVD的计算参考相关文献进行[7]。
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腹腔注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉大鼠，取仰卧位，大鼠专用固定架固定四肢。采用Co-60 γ射线放疗机，0°角单野垂直照射，源皮距100 cm。上界为肋缘下，下界为肛门口，左右界开放，射野面积8 cm × 8 cm，处方深度3 cm，处方剂量参考国内外大鼠卵巢放疗早衰建模相关文献，给予200 cGy，照射1次[8]。
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采用SPSS23.0统计学软件进行数据分析。计量结果采用均数 ± 标准差表示，对数据正态性分布和方差齐性验证后，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较通过单因素方差分析并采用LSD-t法进行多重比较。P < 0.05表示差异有统计学意义。
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在给药后5 d（首个动情周期）内，卵巢FSH和E2水平表现为一过性升高。随后卵巢功能迅速进入中枢性抑制状态，表现为FSH、E2水平的连续下降，至第15天左右（约3个动情周期）时，FSH、E2水平达最低值附近，即卵巢进入最大抑制状态。随后FSH、E2水平逐渐升高，约再过20 d FSH、E2水平基本恢复到给药前水平，即卵巢功能逐渐恢复至给药前状态。而整个过程中AMH水平基本稳定，无显著变化，详见表 3。
激素 0d 5d 10d 15d 20d 25d 30d 35d E2/(pg/mL) 135.55±21.31 187.23±36.45 65.64±14.32 16.83±5.35 24.86±6.21 42.23±13.43 114.95±23.23 168.58±42.15 FSH/(mIU/mL) 8.12±2.37 15.31±4.260 4.65±1.33 1.14±0.38 2.46±0.69 4.17±1.36 7.74±2.05 8.34±3.23 AMH/(pg/mL) 15.37±3.86 14.51±2.71 15.76±3.34 13.28±3.12 16.86±4.13 15.85±4.76 14.64±3.86 17.12±5.15 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂； E2： 雌二醇； FSH： 卵泡刺激素； AMH： 抗苗勒管激素。 表 3 GnRHa 皮下注射后大鼠血清 FSH、 E2 和 AMH 水平的动态变化（x±s）
Table 3. Dynamic changes in serum FSH, E2 and AMH after subcutaneous injection of GnRHa（x±s）
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根据2.1节中所得数据，即皮下给予GnRHa后，至15 d左右大鼠卵巢功能达最大抑制状态，本实验将大鼠盆腔照射时间点设定在GnRHa皮下给药后15 d，而将实验终点设置为盆腔照射后20 d，即GnRHa皮下给药后正常大鼠卵巢激素水平的恢复期。
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实验处理前，各组大鼠的平均体重基本一致，各组间两两比较差异均无统计学意义（F = 0.476，P ＞ 0.05）。实验结束时，R组及GnRHa+R组大鼠平均体重明显减轻，与对照组相比，差异均有统计学意义（t = 2.55和3.45，均P < 0.05）；但R组与GnRHa+R组间平均体重差异无统计学意义（t = 1.01，P ＞ 0.05）；对照组与GnRHa组间平均体重差异亦无统计学意义（t = 0.67，P ＞ 0.05）（表 4）。
组别 只数 大鼠体重/g 卵巢湿重/mg 对照组 10 256.4±12.7 63±11.7 GnRHa组 10 260.4±14.1 57±13.5 放疗组（R组） 10 235.3±14.6a 33±6.3 GnRHa+ R组 10 241.6±13.2ab 55±11.6cd 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂； a： 与对照组及 GnRHa 组相比， 差异有统计学意义（t = 2.55～3.91， 均P < 0.05）； b： 与 R 组相比， 差异无统计学意义（t = 1.01， P ＞ 0.05）； c： 与 R 组比较， 差异有统计学意义（t = 5.27， P < 0.05）； d： 与对照组及 GnRHa 组比较， 差异无统计学意义（t = 1.53 和 0.35， 均 P ＞ 0.05）。 表 4 GnRHa 治疗后各组大鼠体重及卵巢湿重的比较（x±s）
Table 4. Comparison of body weight and wet ovarian weight after GnRHa treatment between different groups（x±s）
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放疗后20 d处死各组大鼠，剖视可见R组双侧卵巢呈暗红色，明显萎缩，卵巢湿重减轻，与GnRHa+R组比较，差异有统计学意义（t = 5.27，P < 0.05)；而GnRHa+R组双侧卵巢略有缩小，表面呈淡红色，无明显皱缩，卵巢湿重与GnRHa组相比，差异无统计学意义（t = 0.35，P ＞ 0.05）（表 4）。
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在GnRHa给药后第15天，即大鼠盆腔照射前2 h，GnRHa组及GnRHa+R组血清FSH、E2水平均显著下降，与对照组相比差异均有统计学意义（t = 6.57～13.73，均P < 0.01），表明卵巢功能已经受到GnRHa的明显抑制；而R组因未给予GnRHa，卵巢功能未受抑制，激素水平正常，与对照组比较差异无统计学意义（t = 0.24和0.55，均P ＞ 0.05）。在实验终点时，GnRHa组血清FSH、E2水平恢复正常，与对照组相比差异无统计学意义（t = 0.37和1.02，均P ＞ 0.05）；而R组及GnRHa+R组与对照组比较，均出现了E2水平的明显下降和FSH水平的大幅升高，表明卵巢功能受损，此时FSH水平的异常升高是由于卵巢功能低下对垂体的负反馈引起的。其中R组E2水平最低，FSH水平上升幅度最为明显，与对照组及GnRHa组相比，差异均有统计学意义（t = 7.20~19.58，均P < 0.01）；而GnRHa+R组虽然E2水平有所下降，FSH水平有一定升高，但变化幅度远不及R组，两组间比较差异有统计学意义（t = 12.79和4.65，均P < 0.01）（表 5）。
组别 只数 放疗前2h 实验终点时 FSH/(mIU/mL) E2/(pg/mL) AMH（/pg/mL） FSH/(mIU/mL) E2/(pg/mL) AMH（/pg/mL） 对照组 10 8.12±3.23 173.55±35.78 15.37±3.13 7.72±4.03 173.36±23.55 16.21±4.27 GnRHa组 10 1.24±0.37 a 19.63±4.81 a 14.51±4.93 8.34±3.43 184.53±25.12 17.34±5.14 放疗组（R组） 10 7.74±3.75 164.64±36.54 15.76±2.17 36.23±11.87b 24.13±6.32 b 4.13±1.56 GnRHa+R组 10 1.35±0.43 a 17.49±3.45 a 13.28±2.08 16.47±6.32c 87.5±14.34 c 09.32±2.45d 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂； FSH： 卵泡刺激素； E2： 雌二醇； AMH： 抗苗勒管激素； a： 与对照组比较， 差异有统计学意义（t = 6.57～13.73， 均 P < 0.01）； b： 与对照组及 GnRHa 组比较， 差异均有统计学意义（t = 7.20~19.58， 均 P < 0.01）； c： 与 R 组比较， 差异有统计学意义（t = 4.65 和 12.79； 均 P < 0.01）； d： 与 R 组比较， 差异有统计学意义（t = 5.65， P < 0.01）。 表 5 GnRHa 治疗前后各组大鼠血清 FSH、 E2 和 AMH 水平的变化情况（x±s）
Table 5. Changes in serum FSH, E2 and AMH in rats before and after GnRHa treatment between different groups（x±s）
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放疗前2 h抽取各组大鼠血样，方差分析结果显示各组间AMH水平差异无统计学意义（F=0.531，P ＞ 0.05）。在实验终点时，GnRHa组AMH水平略高于对照组，但差异无统计学意义（t = 0.53，P ＞ 0.05）；R组的AMH水平下降最为显著；GnRHa+R组AMH水平虽与对照组相比有所下降，但与R组相比显著升高，且差异有统计学意义（t = 5.65，P < 0.01）。这表明GnRHa+R组卵巢储备功能显著好于R组（表 5）。
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卵泡的发育成熟是一个动态连续的过程，需经历原始及初级卵泡、生长卵泡、成熟卵泡这3个过程[9]。为了解GnRHa对卵巢功能的保护作用主要发生于哪一阶段，在实验终点时，切取各组大鼠卵巢，经苏木精-伊红染色后于光镜下观察，计数各组大鼠各期卵泡数（表 6）。结果可见R组各期卵泡数量均较其余各组明显减少，特别是原始及初级卵泡数减少最为明显；而GnRHa+R组与R组相比，生长卵泡和成熟卵泡数间的差异无统计学意义（t = 0.44和0.51，均P ＞ 0.05），但原始及初级卵泡数显著升高，差异有统计学意义（t = 7.70，P < 0.01）。
组别 原始及初级卵泡 生长卵泡 成熟卵泡 对照组 54.7±8.9 31.5±5.7 15.6±4.2 GnRHa组 87.5±16.7 14.3±3.7 8.8±3.2 放疗组（R组） 12.4±6.8 6.3±2.7 3.6±1.2 GnRHa+R组 47.3±12.6 a 5.4±3.4b 3.3±0.8b 注：表中，GnRHa：促性腺激素释放激素激动剂；a:与R组比较，差异有统计学意义(t=7.70，P < 0.01)；b：与R组相比，差异无统计学意义(t=0.44和0.51，P＞0.05)。 表 6 各组大鼠各型卵泡计数比较（x±s）
Table 6. Comparison of various types of follicular counts in rats between different groups（x±s）
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通过凋亡指数统计分析，各组大鼠卵巢中均存在一定比例的凋亡细胞，其中，GnRHa组凋亡指数略高于对照组，但两组比较，差异无统计学意义（t = 0.99，P ＞ 0.05）。放疗是导致卵巢组织凋亡的首要因素，经历了盆腔放疗的R组及GnRHa+R组均出现了显著凋亡，但GnRHa+R组的凋亡程度明显较R组轻，凋亡指数显著低于R组差异有统计学意义（t = 8.20，P < 0.05）（表 7）。而在MVD方面，虽然R组卵巢明显萎缩，但针对血管内皮细胞表面抗原的CD31免疫组化染色结果提示R组MVD明显高于GnRHa+R组，差异有统计学意义（t = 9.83，P < 0.05）（图 1）。
分组 凋亡指数 MVD 对照组 5.7±3.4 42.6±8.6 GnRHa组 7.4±4.2 13.5±3.8 放疗组（R组） 63.5±11.7 35.7±7.9 GnRHa+R组 23.7±9.8 a 10.3±2.1 b 注：表中，GnRHa：促性腺激素释放激素激动剂；MVD：微血管密度；a:与R组比较，差异有统计学意义(t=8.2，P < 0.05)；b：与R组比较，差异有统计学意义(t=9.83，P < 0.05)。 表 7 各组大鼠卵巢组织凋亡指数和微血管密度（x±s）
Table 7. Apoptotic index and MVD in ovarian tissue of rats between different groups（x±s）
图 1 Tunnel 凋亡检测与 CD31 免疫组化染色结果图 图中， 上排图片为荧光素标记的原位 Tunnel 凋亡检测荧光染色照片（×100）， 其中 R 组（C）凋亡小体（黑色背景下绿色亮点）数目显著高于 GnRHa+R 组（D）， 而对照组（A）及 GnRHa 组（B）凋亡均不明显； 下排图片为血管内皮细胞表面标记免疫组化 CD31 染色照片（×100）， 图中黄褐色为免疫组化阳性染色部位的血管内皮细胞， 可见 GnRHa 组（F）微血管密度显著低于对照组（E）， GnRHa+R 组（H）微血管密度显著低于 R 组（G）。
Figure 1. Tunnel apoptosis detection and CD31 staining
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放疗是恶性肿瘤最为重要的治疗手段之一，特别是对于宫颈癌、内膜癌等妇科恶性肿瘤[10]。卵巢是放射线超敏器官，较低的剂量即可能对卵巢功能造成严重损伤[11]。如何在减轻卵巢受照剂量的同时，辅之以其他有效手段来尽可能地保护卵巢功能，成为一个亟待解决的问题。
有研究表明，在乳腺癌等肿瘤化疗前给予GnRHa能够减少57%的卵巢功能早衰[12]。化疗药物多作用于细胞的DNA双链，放疗与之具有相同的关键靶，因此有理由推断GnRHa亦能对放疗中的卵巢产生保护作用。由于放射线对细胞的杀伤呈现细胞周期依赖性，不同的细胞周期对放射线的敏感性有很大不同，因此确定GnRHa的给药时间与放疗间隔时间具有重要意义。本研究中我们观察到在GnRHa给药后的首个动情周期内，FSH及E2水平不降反升，这是由于在GnRHa首次给药初期，具有短暂刺激FSH和促黄体素水平升高的反跳作用，即点火效应（Flare-up）[13]。因此在确定放疗时间时，通过对激素水平的连续动态观测，避开了点火效应期，选择了GnRHa给药后的第15天，即卵巢功能最大抑制状态下给予盆腔照射，这与其他多个针对化疗的GnRHa实验的结论一致[14-15]。
研究中我们观察到R组与GnRHa+R组平均体重较对照组减轻，我们推测这可能与盆腔照射导致的胃肠道应激有一定关系。在卵巢湿重方面，GnRHa+R组显著高于R组，R组内卵巢可见大量闭锁卵泡和间质纤维化，卵巢外形明显萎缩。在激素水平方面，FSH和E2是目前反映卵巢功能最为常用的激素指标，放疗后GnRHa+R组卵巢功能虽然也出现了一定程度的损伤，表现为E2水平的降低和FSH水平的异常升高，但与R组相比，损伤程度显著较轻。而这也在随后的AMH水平检测中得到了进一步的验证。AMH是由卵巢小卵泡的颗粒层细胞所分泌，卵巢小卵泡数目越多，血清中的AMH水平越高。AMH属于转化生长因子β超家族成员，是新近发现的反映卵巢储备功能的细胞因子[16]。AMH水平与卵巢功能密切相关，在提示卵巢储备时较常用的 FSH、E2等指标更敏感、更稳定，且不易受动情周期的影响[17]。前述实验结果也表明了正常大鼠在给予GnRHa后，虽然FSH、E2水平均出现显著下降，但AMH水平并未受明显影响。因此AMH水平可以间接反映卵巢里的卵泡库存量，即卵巢的储备功能[18]。我们发现，放疗后GnRHa+R组AMH水平显著高于R组。
除了FSH、E2、AMH外，卵泡数量是直观反映卵巢储备功能的参数，尤其是原始及初级卵泡数。通常哺乳动物的每个动情期会有多个卵泡同时发育，但一般只有少数几个能发育成熟并排卵，其余的卵泡发育至不同阶段自行萎缩凋亡。既往有研究表明，极低剂量的放射线就能够促进发育过程中的生长卵泡及成熟卵泡走向凋亡，并导致不育[19]。放射线的杀伤作用部分依赖氧分子的存在，多个研究已经证实，氧是放疗最为有效的增敏剂之一，而乏血管的肿瘤往往因为组织氧合差，导致放疗抵抗[20]。在处死大鼠后的各组卵巢分类计数中，我们发现GnRHa组与对照组卵泡总数虽然无明显差别，但GnRHa组的原始及初级卵泡数显著高于对照组，这说明GnRHa能够通过抑制FSH 和促黄体素，将卵泡的发育阻滞在原始及初级卵泡阶段，避免其进入对放射线敏感的生长卵泡及成熟卵泡阶段。而在R组，虽然其生长卵泡及成熟卵泡数略高于GnRHa+R组，但其原始及初级卵泡几乎耗竭。有研究推测这可能是由于外界有害因素对卵巢的损伤是一个动态循环过程，其首先使得成熟卵泡丢失，继而垂体在负反馈作用机制下增加FSH的分泌，进而促使更多卵泡发育以补充成熟卵泡，随之又被破坏，形成一个恶性循环，从而加速了卵巢储备卵泡的耗竭[21]。
氧是放射线损伤最强的增敏剂。通过观察CD31免疫染色的卵巢切片，我们发现GnRHa+R组卵巢组织内的平均血管密度明显低于R组，这意味着卵巢组织内血液灌注和氧合明显降低。由此我们推断，GnRHa可能通过减少卵巢血供，降低卵巢代谢和组织氧合，降低其对放射损伤的敏感性，这亦可能是其保护机制之一。
综上所述，本研究结果初步表明GnRHa能够通过诱导卵巢“休眠”，降低放疗对卵巢功能的损伤，它的主要机制可能在于将卵泡阻滞在对放射线相对不敏感的原始及初级卵泡阶段，以及降低卵巢血供和组织氧合，进而降低卵巢对放射损伤的敏感性。
虽然本研究结果初步揭示了GnRHa对卵巢放射损伤的保护效果，但由于GnRHa点火效应的存在，需要在GnRHa给药后2周左右方可开始放疗，这对其临床应用造成了一定限制。有研究表明，促性腺激素释放激素拮抗剂相比GnRHa对性腺轴的抑制作用更强，起效更快，且无点火效应，有望较GnRHa获得更好的卵巢保护效果[22]，但其在放疗防护中的应用还有待进一步的研究证实。
促性腺激素释放激素激动剂对辐射所致大鼠卵巢功能损伤的防护作用研究
Protective effect of gonadotropin-releasing hormone agonist on ovarian functional impairment caused by radiation in rats
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摘要:
目的探讨促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）对盆腔放疗辐射所致大鼠卵巢功能损伤的保护作用及可能机制。 方法实验1：雌性Fischer 344大鼠5只，于动情间期皮下给予GnRHa 0.25 mg后，动态观察其血清卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）及抗苗勒管激素（AMH）水平变化情况。实验2：雌性大鼠40只，以随机数字表法分为对照组、GnRHa组、放疗组（R组）及GnRHa+R组并给予相应处理，盆腔照射后20 d，采用单因素方差分析及独立样本t检验比较各组间的体重、卵巢湿重、血清FSH、E2、AMH水平及卵泡数量的差异。对比各组大鼠卵巢凋亡指数和微血管密度。 结果实验1：皮下给予GnRHa后，大鼠卵巢功能受到抑制，FSH、E2水平持续下降，15 d左右达到谷值，再过20 d后恢复至给药前水平。实验2：盆腔放疗后，GnRHa+R组、R组与对照组相比均出现不同程度的卵巢功能损伤，但GnRHa+R组与R组相比受损程度较轻，表现为E2水平偏高（t=12.79，P < 0.01），FSH水平偏低（t=4.65，P < 0.01），AMH水平偏高（t=5.65，P < 0.01）；卵泡计数显示，GnRHa+R组的原始及初级卵泡数显著高于R组（t=7.70，P < 0.01）；Tunnel和CD31染色结果显示R组卵巢内细胞凋亡指数和微血管密度显著高于GnRHa+R组（t=8.20和9.83，均P < 0.05）。 结论放疗前应用GnRHa能够有效减轻放疗辐射对大鼠卵巢功能的损伤，这可能与GnRHa将卵泡发育抑制在原始、初级卵泡阶段以及减少卵巢组织血供及氧合进而降低卵巢放射敏感性有关。 -
关键词:
- 辐射耐受性 /
- 放射疗法 /
- 卵巢 /
- 辐射防护 /
- 促性腺激素释放激素激动剂
Abstract:Objective To investigate the protective effect of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa) on ovarian function in rats during pelvic irradiation and its possible mechanism. Methods 1. Five female Fischer-344 rats were subcutaneously injected with 0.25 mg of GnRHa. Changes in serum follicle -stimulating hormone(FSH), estradiol(E2), and anti -mullerian hormone(AMH) levels were observed continually. 2. Forty female rats were randomly divided into four groups(Control, GnRHa, R, and GnRHa+ R) and given their corresponding treatments. At 20 days after pelvic irradiation, the weight; ovarian wet weight; serum FSH, E2, and AMH levels; and follicular numbers of the four groups were compared using one-way ANOVA and independent-sample t-test. The apoptotic index and microvessel density(MVD) in the ovarian tissue of each group were also compared. Results 1. Treatment with GnRHa inhibited ovarian function. Under this treatment, serum FSH and E2 declined, reached the minimum values in approximately 15 days, and then normalized in approximately 20 days. 2. After pelvic radiotherapy, the GnRHa+R and R groups showed different degrees of ovarian function damage compared with the control group, but the damage to the GnRHa +R group was less severe compared with that to the other groups. The GnRHa +R group showed higher E2(t=12.79, P < 0.01), lower FSH(t=4.65, P < 0.01), and relatively higher AMH (t=5.65, P < 0.01) compared with the R group. Follicular classification revealed significantly more primordial and primary follicles in the GnRHa+R group than in the R group(t=7.70, P < 0.01). Tunnel and CD31 staining showed that the apoptotic index and MVD were significantly higher in the R group than in the GnRHa+R group(t=8.20 and 9.83, both P < 0.05). Conclusions Administration of GnRHa before radiotherapy can significantly decrease radiation damage to ovarian function in rats. GnRHa exerts its protective effect against ovarian functional impairment by inhibiting follicular development in primordial and primary follicles. It decreases the blood supply and oxygen of ovarian tissue, thereby reducing the radiation sensitivity of the ovary. -
图 1 Tunnel 凋亡检测与 CD31 免疫组化染色结果图 图中， 上排图片为荧光素标记的原位 Tunnel 凋亡检测荧光染色照片（×100）， 其中 R 组（C）凋亡小体（黑色背景下绿色亮点）数目显著高于 GnRHa+R 组（D）， 而对照组（A）及 GnRHa 组（B）凋亡均不明显； 下排图片为血管内皮细胞表面标记免疫组化 CD31 染色照片（×100）， 图中黄褐色为免疫组化阳性染色部位的血管内皮细胞， 可见 GnRHa 组（F）微血管密度显著低于对照组（E）， GnRHa+R 组（H）微血管密度显著低于 R 组（G）。
Figure 1. Tunnel apoptosis detection and CD31 staining
表 1 大鼠动情周期判断标准
Table 1. Criterion for determination of estrous cycle in rats
动情周期 阴道分泌物特点 动情前期 膨大及呈椭圆形的有核上皮细胞占主体，偶见角化上皮细胞及散在白细胞 动情期 外形不规则的大量角化上皮细胞堆积成团，少量白细胞 动情后期 不规则的角化上皮细胞、有核上皮细胞及白细胞，三者比例接近 动情间期 细胞数稀少，主要为白细胞及黏液 
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表 2 大鼠分组与对应处理方案
Table 2. Grouping and corresponding treatment schemes
治疗分组 处理方案 对照组 第一天生理盐水100μl皮下注射 GnRHa组 第一天GnRHa 0.25mg皮下注射 放疗组（R组） 第一天生理盐水100μl皮下注射，第16天给予盆腔200cGy照射一次 GnRHa+R组 第一天GnRHa 0.25mg皮下注射, 第16天给予盆腔200cGy照射一次 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂。
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表 3 GnRHa 皮下注射后大鼠血清 FSH、 E2 和 AMH 水平的动态变化（x±s）
Table 3. Dynamic changes in serum FSH, E2 and AMH after subcutaneous injection of GnRHa（x±s）
激素 0d 5d 10d 15d 20d 25d 30d 35d E2/(pg/mL) 135.55±21.31 187.23±36.45 65.64±14.32 16.83±5.35 24.86±6.21 42.23±13.43 114.95±23.23 168.58±42.15 FSH/(mIU/mL) 8.12±2.37 15.31±4.260 4.65±1.33 1.14±0.38 2.46±0.69 4.17±1.36 7.74±2.05 8.34±3.23 AMH/(pg/mL) 15.37±3.86 14.51±2.71 15.76±3.34 13.28±3.12 16.86±4.13 15.85±4.76 14.64±3.86 17.12±5.15 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂； E2： 雌二醇； FSH： 卵泡刺激素； AMH： 抗苗勒管激素。
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表 4 GnRHa 治疗后各组大鼠体重及卵巢湿重的比较（x±s）
Table 4. Comparison of body weight and wet ovarian weight after GnRHa treatment between different groups（x±s）
组别 只数 大鼠体重/g 卵巢湿重/mg 对照组 10 256.4±12.7 63±11.7 GnRHa组 10 260.4±14.1 57±13.5 放疗组（R组） 10 235.3±14.6a 33±6.3 GnRHa+ R组 10 241.6±13.2ab 55±11.6cd 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂； a： 与对照组及 GnRHa 组相比， 差异有统计学意义（t = 2.55～3.91， 均P < 0.05）； b： 与 R 组相比， 差异无统计学意义（t = 1.01， P ＞ 0.05）； c： 与 R 组比较， 差异有统计学意义（t = 5.27， P < 0.05）； d： 与对照组及 GnRHa 组比较， 差异无统计学意义（t = 1.53 和 0.35， 均 P ＞ 0.05）。
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表 5 GnRHa 治疗前后各组大鼠血清 FSH、 E2 和 AMH 水平的变化情况（x±s）
Table 5. Changes in serum FSH, E2 and AMH in rats before and after GnRHa treatment between different groups（x±s）
组别 只数 放疗前2h 实验终点时 FSH/(mIU/mL) E2/(pg/mL) AMH（/pg/mL） FSH/(mIU/mL) E2/(pg/mL) AMH（/pg/mL） 对照组 10 8.12±3.23 173.55±35.78 15.37±3.13 7.72±4.03 173.36±23.55 16.21±4.27 GnRHa组 10 1.24±0.37 a 19.63±4.81 a 14.51±4.93 8.34±3.43 184.53±25.12 17.34±5.14 放疗组（R组） 10 7.74±3.75 164.64±36.54 15.76±2.17 36.23±11.87b 24.13±6.32 b 4.13±1.56 GnRHa+R组 10 1.35±0.43 a 17.49±3.45 a 13.28±2.08 16.47±6.32c 87.5±14.34 c 09.32±2.45d 注： 表中， GnRHa： 促性腺激素释放激素激动剂； FSH： 卵泡刺激素； E2： 雌二醇； AMH： 抗苗勒管激素； a： 与对照组比较， 差异有统计学意义（t = 6.57～13.73， 均 P < 0.01）； b： 与对照组及 GnRHa 组比较， 差异均有统计学意义（t = 7.20~19.58， 均 P < 0.01）； c： 与 R 组比较， 差异有统计学意义（t = 4.65 和 12.79； 均 P < 0.01）； d： 与 R 组比较， 差异有统计学意义（t = 5.65， P < 0.01）。
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表 6 各组大鼠各型卵泡计数比较（x±s）
Table 6. Comparison of various types of follicular counts in rats between different groups（x±s）
组别 原始及初级卵泡 生长卵泡 成熟卵泡 对照组 54.7±8.9 31.5±5.7 15.6±4.2 GnRHa组 87.5±16.7 14.3±3.7 8.8±3.2 放疗组（R组） 12.4±6.8 6.3±2.7 3.6±1.2 GnRHa+R组 47.3±12.6 a 5.4±3.4b 3.3±0.8b 注：表中，GnRHa：促性腺激素释放激素激动剂；a:与R组比较，差异有统计学意义(t=7.70，P < 0.01)；b：与R组相比，差异无统计学意义(t=0.44和0.51，P＞0.05)。
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表 7 各组大鼠卵巢组织凋亡指数和微血管密度（x±s）
Table 7. Apoptotic index and MVD in ovarian tissue of rats between different groups（x±s）
分组 凋亡指数 MVD 对照组 5.7±3.4 42.6±8.6 GnRHa组 7.4±4.2 13.5±3.8 放疗组（R组） 63.5±11.7 35.7±7.9 GnRHa+R组 23.7±9.8 a 10.3±2.1 b 注：表中，GnRHa：促性腺激素释放激素激动剂；MVD：微血管密度；a:与R组比较，差异有统计学意义(t=8.2，P < 0.05)；b：与R组比较，差异有统计学意义(t=9.83，P < 0.05)。
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