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恶性肿瘤的发病率逐年上升，而对恶性肿瘤的早诊断和早治疗是影响到恶性肿瘤预后的关键因素，因此，如何对恶性肿瘤进行早期诊断和治疗是目前研究的热点和难点。整合素αvβ3因在肿瘤新生血管中高度表达而在正常血管低表达或不表达，成为了肿瘤相关领域的研究热点。通过噬菌体肽库筛选得到的小分子多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）具有与整合素αvβ3特异性结合的能力，目前大量的研究用放射性核素131I、99Tcm等对RGD及其衍生模序进行标记，针对恶性肿瘤进行靶向治疗或显像，研究结果表明其具有较好的优越性和潜在的应用价值[1-2]。
除RGD能够与整合素αvβ3特异性结合外，天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg，NGR）小肽分子中的天冬酰胺能够通过脱酰胺作用形成异天冬氨酸（isoAsp，isoD），使NGR变为isoDGR，从而被整合素αvβ3特异性识别并结合[3]。Curnis等[4]通过将含有isoDGR序列的CisoDGRC与TNF融合形成isoDGR-TNF，结果发现无论是单独使用还是联合化疗药物，极低剂量的isoDGR-TNF（1~10 pg）即可以产生对荷淋巴瘤或纤维肉瘤裸鼠的抗肿瘤作用，这种抗肿瘤作用可以通过同时加入过量的游离CisoDGRC得到充分的抑制，而且isoDGR-TNF的抗肿瘤活性明显强于单纯的TNF。因此作者认为isoDGR是一种能够与αvβ3结合的模序。131I标记的isoDGR兔VX2恶性肿瘤SPECT显像研究也表明isoDGR对恶性肿瘤具有一定的靶向性[5]。本研究用99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C（其中，MAG3为β-N-巯基乙酰基-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰；C为Cys），探讨最佳标记条件，测定标记物体外稳定性及在正常小鼠体内的生物学分布，为后期的显像和治疗实验提供基础。
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材料：99Mo/99Tcm发生器由北京原子高科核技术应用股份有限公司提供；MAG3-isoDGR-2C（图 1）由北京中科亚光生物科技有限公司合成，纯度为97.03%；葡庚糖酸盐（glucoheptonate，GH）药盒由北京师宏药物研制中心提供；乙腈（色谱纯）购自北京依诺凯试剂有限公司；三氟乙酸、醋酸、醋酸钠等试剂均购自北京化工厂；聚酰胺薄膜购自浙江台州市路桥四甲生化塑料厂；昆明小鼠（雌性，清洁级，体重18~20 g）购自北京兴隆养殖场。
图 1 MAG3-isoDGR-2C的分子结构图
Figure 1. Molecular structure of MAG3-isoDGR-2C
仪器：FM-2000锝分析仪购自西安凯普机电有限责任公司；Waters 500 TR液相色谱仪购自美国Waters公司；FJ-391型同位素活度计购自北京核仪器厂。
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1 mg MAG3-isoDGR-2C中加入1 mL注射用水，配置成1 mg/mL的水溶液。
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利用GH转换络合法行99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C前先进行99TcmO-GH中间体的制备。GH药盒中加入1 mL新鲜的Na99TcmO4溶液（240.5 MBq），摇匀后室温放置15 min即可得到99TcmO-GH。采用薄层色谱法鉴定其放射化学纯度，展开剂分别为生理盐水和乙腈，支撑物为聚酰胺薄膜。
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2 mL离心管中加入10 μL MAG3-isoDGR-2C溶液后，加入200 μL pH值为4.6的醋酸-醋酸钠（HAc-NaAc）缓冲液，再加入99TcmO-GH中间体（2.405 MBq），充分摇匀后分别在室温（24℃）及沸水浴（100℃）条件下反应15 min。
采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行放射化学纯度的鉴定，流动相为：A相，H2O（含0.1%三氟乙酸）；B相，乙腈（含0.1%三氟乙酸）。淋洗梯度如表 1所示。
时间/min 0 17 19 21 26 B相百分比/% 0 17 50 100 0 表中，HPLC：高效液相色谱；B相为乙腈。 表 1 HPLC法对标记物进行放化纯鉴定的淋洗梯度
Table 1. Gradient elution of HPLC in determining the radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C
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2 mL离心管中加入10 μL MAG3-isoDGR-2C溶液后，分别加入200 μL的HAc-NaAc缓冲液（pH值分别为8、6、5.8、4.6），然后加入10 μL 99TcmO-GH中间体（2.405 MBq），充分摇匀后100℃反应15 min。参照1.4的方法对其进行鉴定。
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将标记好的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温中分别放置30、60、120、240和360 min后，采用HPLC进行放化纯的鉴定，观察其体外的稳定性。
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将30只昆明小鼠随机分为6组，每组5只，分别经尾静脉注射0.1 mL标记成功的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C（11.1 MBq），分别于注射后15、30、60、120、240、360 min将小鼠断颈处死，迅速收集血液，解剖并取出心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、骨骼、肌肉、肠道、甲状腺等，分别称重并用锝分析仪测定计数，计算各脏器的放射性摄取率（%ID/g）。
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本研究主要采用薄层色谱法对99TcmO-GH中间体进行鉴定，各组分的比移值如表 2所示。在两种薄层色谱体系下，各组分的比移值各不同，可以用于鉴定99TcmO-GH中间体。鉴定结果表明，99TcmO-GH中间体的放化纯为96.28%，可用于后续多肽的标记。
2.2温度对99Tcm-MAG3-isoDGR-2C标记率的影响
层析体系 99TcmO4- 99TcmO2·nH2O 99TcmO-GH 聚酰胺-生理盐水 0~0.1 0~0.1 0.8~1.0 聚酰胺-乙腈 0.3~0.6 0~0.1 0~0.1 表 2 99TcmO、99TcmO2·nH2O和99TcmO-GH在不同层析体系中的比移值
Table 2. Flow rate of the materials in different chromatography systems
实验结果表明，在室温条件下反应15 min时，HPLC图上未明显显示出保留时间为24 min的峰，说明在该条件下，MAG3-isoDGR-2C不能够与99TcmO-GH进行配体交换；而在沸水浴（100℃）条件下反应15 min时，在保留时间为24 min附近出现了较高的放射性峰，说明在该条件下能得到99Tcm-MAG3-isoDGR-2C配合物，且标记率为94.2%（图 2）。
图 2 温度为100℃、pH=4.6时99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的高效液相色谱图
Figure 2. High performance liquid chromatogram to determine the radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C underoptimal conditions
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实验结果表明，当pH值逐渐减小时，放射化学纯度逐渐增加，即：当pH=8.0和pH=6.0时，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的HPLC图均为多重峰；当pH=5.8时，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化学纯度为86.78%；当pH=4.6时，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化学纯度为94.2%。
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标记成功的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温中放置360 min后，虽然放射化学纯度有所降低，但仍能够保持在90%以上（图 3），表明该标记物在室温条件下稳定性较好。
图 3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温条件下的稳定性
Figure 3. Stability of 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in vitro
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99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布结果如表 3所示。由表 3可以看出，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在小鼠体内的血液清除较快，在60和120 min时血液里只有0.48和0.33%ID/g，而到240 min时仅剩下0.17%ID/g。各个时间点肾脏的放射性摄取均是最多的，但随着时间的延长，其放射性摄取逐渐减低；而肝脏和肠道的摄取都相对较多，60 min时的摄取分别是2.44%ID/g和1.69%ID/g；其余器官的放射性摄取均较低，心脏、肺、脾、胃、骨骼在60 min时的摄取率分别为0.23、0.41、0.19、0.27和0.27%ID/g。
组织或器官 15 min 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min 心脏 0.67±0.07 0.41±0.12 0.23±0.01 0.17±0.12 0.08±0.03 0.07±0.03 肝脏 4.79±0.46 3.38±0.78 2.44±0.22 2.29±0.37 1.75±0.14 1.74±0.39 肺 1.68±0.24 0.99±0.21 0.41±0.03 0.35±0.08 0.18±0.03 0.18±0.08 肾脏 8.02±1.38 5.95±1.96 3.60±0.32 2.85±0.42 2.11±0.44 2.01±0.96 脾 0.59±0.06 0.38±0.11 0.19±0.04 0.17±0.05 0.12±0.01 0.07±0.01 胃 0.49±0.11 0.35±0.10 0.27±0.05 0.25±0.15 0.17±0.31 0.12±0.32 骨骼 0.98±0.21 0.65±0.12 0.27±0.07 0.25±0.04 0.16±0.03 0.15±0.05 肌肉 0.49±0.07 0.41±0.11 0.16±0.02 0.11±0.03 0.06±0.01 0.04±0.01 肠道 2.67±0.61 2.26±0.96 1.69±0.17 0.62±1.03 0.46±0.13 0.20±0.08 血 2.14±0.31 1.16±0.28 0.48±0.06 0.33±0.03 0.17±0.02 0.15±0.02 甲状腺 1.74±0.10 1.20±0.13 0.78±0.05 0.67±0.29 0.46±0.16 0.45±0.24 表 3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布[（x±s）%ID/g, n=5]
Table 3. Biodistribution of 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in normal mice[(x±s)%ID/g, n=5]
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isoDGR-2C为小分子肽，其相对分子质量为839.79，与大分子蛋白质及多肽相比，其相对分子质量小，具有以下优点：（1）与受体的亲和力可能比受体和受体片段更强；（2）易于合成、易于结构修饰；（3）很少引起免疫反应；（4）能够有效地避免肝脏、脾脏及肾脏的过度摄取，而且快速的血液清除可以提供高靶与非靶比值，改善显像质量。在isoDGR两端加入半胱氨酸是为了保护核心多肽（isoDGR）的稳定性，而在小分子肽的分子结构中引入螯合基团MAG3并不影响它们与受体结合的特性，而且更加容易标记。
虽然目前已经有研究者对核素标记的isoDGR进行了相关的研究和报道，但研究使用的放射性核素为131I，而99Tcm与131I比较具有以下优越性[6-7]：99Tcm是临床上最常用的放射性核素，其具有优良的核素性能，是纯γ光子发射体，得到的SPECT图像质量更加清晰；99Tcm半衰期为6.02 h，为前期放射性显像剂的合成预留了足够时间；通过99Mo/99Tcm发生器制备，容易获得；标记过程相对简单。另外，131I进行标记的过程中还需要对标记物进行纯化，这不利于后期试验的开展。
采用转换络合法进行放射性核素99Tcm对多肽的标记具有能够较好地保持多肽的生物学活性的优点[8-10]，因此，本研究采用GH转换络合法进行放射性核素99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C，在对标记条件进行优化后，得到了放射化学纯度达到94%以上的配合物，且标记方法相对简单，体外稳定性好。
体内生物学分布的研究显示了该标记物能够较快地从血液中清除；肾脏的放射性摄取在各个时间点都是最多的，但随着时间的延长，其放射性摄取也在逐渐降低，说明该标记物主要经泌尿系统排泄，这可能与其具有较高的水溶性有关；而肝脏和肠道的摄取都相对较多，这可能是因为该标记物需要从肝脏进行代谢，进而通过肠道排出体外所致；心脏、肺、脾、胃、骨骼等的放射性摄取都很少，这能够有效地减低本底的摄取。
总之，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C具备一定的成为SPECT显像剂的基础，而本研究为后续的该标记物在荷瘤鼠体内的生物学分布以及SPECT显像研究提供了基础和实验准备。
99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探针的制备与体内分布的实验研究
Labeling MAG3-isoDGR-2C with 99Tcm and its biodistribution in mice
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摘要:
目的 摸索99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探针的标记条件并研究其在正常昆明小鼠体内的生物学分布。 方法 利用葡庚糖酸盐（GH）转换络合法进行标记，即首先用99Tcm标记GH形成99TcmO-GH中间体，再进行99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的标记；考察pH值和温度等因素对标记率的影响，采用高效液相色谱法鉴定标记物的放射化学纯度；取30只昆明小鼠随机分成6组，分别于注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C 15、30、60、120、240和360 min后测定其在小鼠体内的分布情况。 结果 pH值为4.6、反应温度为100℃时的标记率最高（94.2%）。体内分布研究显示该标记物能够较快地从血液中清除，且心、肺、脾、胃、骨等组织的放射性摄取均很少。 结论 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C标记率高、血液清除快，具备一定的成为SPECT显像剂的条件。 -
关键词:
- 分子探针 /
- 同位素标记 /
- 异天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸 /
- 体内分布
Abstract:Objective To analyze the feasibility of labeling MAG3-isoDGR-2C with 99Tcm and investigate the biodistribution of the tracer in normal mice. Methods Glucoheptonate was initially labeled with 99Tcm as the intermediate, followed by MAG3-isoDGR-2C. High-performance liquid chromatography was employed to determine the radiochemical purity. The biodistribution of 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C was studied at 15, 30, 60, 120, 240 and 360 min after caudal vein injection in normal mice. Results MAG3-isoDGR-2C was successfully labeled with 99Tcm, and the radiochemical purity was 94.2%. The biodistribution revealed that the tracer was rapidly cleared out from the blood with mild activity in the heart, lung, spleen, stomach, and bone. Conclusions MAG3-isoDGR-2C was labeled with 99Tcm with high radiochemical purity, and the tracer could be cleared out quickly. Therefore, MAG3-isoDGR-2C is a potential molecular tracer in the study of early cancer diagnosis. -
Key words:
- Molecular probes /
- Isotope labeling /
- IsoAsp-Gly-Arg /
- Biodistribution
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图 2 温度为100℃、pH=4.6时99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的高效液相色谱图
Figure 2. High performance liquid chromatogram to determine the radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C underoptimal conditions
图 3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温条件下的稳定性
Figure 3. Stability of 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in vitro
表 1 HPLC法对标记物进行放化纯鉴定的淋洗梯度
Table 1. Gradient elution of HPLC in determining the radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C
时间/min 0 17 19 21 26 B相百分比/% 0 17 50 100 0 表中，HPLC：高效液相色谱；B相为乙腈。 
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表 2 99TcmO、99TcmO2·nH2O和99TcmO-GH在不同层析体系中的比移值
Table 2. Flow rate of the materials in different chromatography systems
层析体系 99TcmO4- 99TcmO2·nH2O 99TcmO-GH 聚酰胺-生理盐水 0~0.1 0~0.1 0.8~1.0 聚酰胺-乙腈 0.3~0.6 0~0.1 0~0.1
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表 3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布[（x±s）%ID/g, n=5]
Table 3. Biodistribution of 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in normal mice[(x±s)%ID/g, n=5]
组织或器官 15 min 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min 心脏 0.67±0.07 0.41±0.12 0.23±0.01 0.17±0.12 0.08±0.03 0.07±0.03 肝脏 4.79±0.46 3.38±0.78 2.44±0.22 2.29±0.37 1.75±0.14 1.74±0.39 肺 1.68±0.24 0.99±0.21 0.41±0.03 0.35±0.08 0.18±0.03 0.18±0.08 肾脏 8.02±1.38 5.95±1.96 3.60±0.32 2.85±0.42 2.11±0.44 2.01±0.96 脾 0.59±0.06 0.38±0.11 0.19±0.04 0.17±0.05 0.12±0.01 0.07±0.01 胃 0.49±0.11 0.35±0.10 0.27±0.05 0.25±0.15 0.17±0.31 0.12±0.32 骨骼 0.98±0.21 0.65±0.12 0.27±0.07 0.25±0.04 0.16±0.03 0.15±0.05 肌肉 0.49±0.07 0.41±0.11 0.16±0.02 0.11±0.03 0.06±0.01 0.04±0.01 肠道 2.67±0.61 2.26±0.96 1.69±0.17 0.62±1.03 0.46±0.13 0.20±0.08 血 2.14±0.31 1.16±0.28 0.48±0.06 0.33±0.03 0.17±0.02 0.15±0.02 甲状腺 1.74±0.10 1.20±0.13 0.78±0.05 0.67±0.29 0.46±0.16 0.45±0.24
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