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BLM结合蛋白75（BLM-associated polypeptides 75，BLAP75）是一个相对分子质量为75×103的蛋白质，它在维持基因组稳定性方面具有非常重要的作用[1-2]。既往研究表明，BLAP75通过与RecQ家族DNA解螺旋酶BLM以及DNA拓扑异构酶TopoⅢα紧密结合，形成BLM-TopoⅢα-BLAP75（BTB）复合物直接参与DNA双链断裂（double-strand break，DSB）的同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）过程[3-4]，从而发挥维持基因组稳定性的作用。电离辐射（ionizing radiation，IR）对人体造成伤害的主要原因之一是引起DSB，HRR是真核细胞准确修复DSB的一个最主要的途径[5]。此外，IR诱导DNA损伤还会激起细胞中的DNA损伤反应，从而激活许多蛋白激酶、损伤效应分子以及DNA修复蛋白。由于已经发现BLM蛋白在IR诱导的DNA损伤修复中具有多重作用[6-7]，因此，推测BLAP75很可能在IR诱导的DNA损伤修复中也有重要作用。本研究采用RNA干扰技术在细胞中沉默BLAP75基因来研究BLAP75究竟如何影响IR诱导DNA损伤修复。
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人胚肾上皮293T细胞由本实验室保存，用含10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2的条件下培养。Trizol、培养基Opti-MEM® I Reduced Serum Medium和Lipofectamine RNAiMAX均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Quanti Tect反转录试剂盒购自德国Qiagen公司；SYBR Green预混合物购自瑞士Roche公司。BCA（bicinchoninic acid）蛋白定量试剂盒购自日本Takara公司；基因定点突变试剂盒QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit购自美国Stratagene公司；BLAP75抗体购自武汉三鹰Proteintech公司；磷酸化p53抗体、细胞周期检查点激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）抗体和磷酸化Chk2抗体均购自美国Cell Signaling Technology；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞γ射线照射采用铯源137Cs（加拿大原子能公司，CAMMA-CELL40），剂量率为0.873 Gy/min。
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本研究中使用的两种BLAP75 siRNA（BLAP75 siRNA1组和BLAP75 siRNA2组）由上海吉玛生物有限公司合成，其序列分别为5′-AGCCTTCACGAATGTTGAT-3′和5′-TCTAGTTACAGCTGAAGCA-3′。非特异的阴性对照Control siRNA也由上海吉玛生物有限公司提供，序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。转染试剂为Lipofectamine RNAiMAX，具体步骤如下：转染前1 d使用不含抗生素的培养基，将293T细胞接种到6孔板中，使细胞密度在转染时约达到40%。转染时，取50 pmol的siRNA用250 μl无血清无抗生素的Opti-MEM培养基稀释混匀，另取4 μl的Lipofectamine RNAiMAX也用250 μl同样的培养基稀释混匀，5 min后将以上两部分混合，室温孵育20 min，将全部500 μl混合物滴加入6孔板中，轻轻混匀，72 h后收集细胞。
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收集并裂解转染了siRNA的293T细胞，提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测总蛋白浓度。取30 μg总蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，采用半干转移法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h，于4 ℃一抗孵育过夜，洗膜，室温孵育相应的二抗1 h，再次洗膜后采用增强化学发光法检测蛋白水平。
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收集转染了siRNA的293T细胞，用Trizol提取细胞中的总RNA，然后用Quanti Tect反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA。使用SYBR Green预混合物，按说明书要求添加引物和模板，每个PCR反应的总体积为20 μl。qPCR反应程序：95 ℃10 min激活DNA聚合酶；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；溶解曲线程序为机器默认设置。qPCR反应中所用引物如下：
BLAP75引物：
（正向）5′-TGCTGCTGTTCCTCGTGGTAATAG-3′
（反向）5′-GATCAGTAAGGAGCCACTGCTCAA-3′
GAPDH引物：
（正向）5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′
（反向）5′-GCTCCTGGAAGATGGTGATG-3′
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将BLAP75 siRNA1或者阴性对照Control siRNA转染293T细胞72 h后，与未转染siRNA的293T细胞一起受4 Gy或10 Gy剂量照射，然后立即收集细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml。取30 μl细胞悬液与70 μl 7.5%低熔点凝胶混匀后迅速铺在7.5%正常熔点凝胶上，在pH=10的碱性裂解液中裂解2.5 h，电泳液中解旋20 min，电泳20 min，在pH=7.5的中和液中中和20 min。2 μg/ml的溴化乙锭染色30 s后，于超纯水中漂洗后荧光显微镜下观察并拍摄不少于100个细胞。用彗星分析软件（CASP软件）分析细胞，包括尾部DNA百分比、尾矩和Olive尾矩。另外，将抵抗BLAP75 siRNA1的表达质粒转入已转染BLAP75 siRNA1的细胞中，48 h后进行同样条件的单细胞凝胶电泳实验，即BLAP75 siRNA1+ BLAP75组。
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为了确保RNA干扰后的实验细胞表型是由沉默BLAP75所致，本研究还构建了抵抗BLAP75 siRNA1的BLAP75表达质粒，即用Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit将野生型BLAP75表达质粒进行定点突变，改变BLAP75 siRNA1靶序列中的4个核苷酸，该突变不会改变编码的氨基酸序列。DNA测序验证构建的新质粒序列。
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数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验，数据以均数±标准差（$\bar x \pm s$）表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。
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如图 1所示，在两种BLAP75 siRNA转染的细胞中BLAP75 mRNA水平都显著降低，同时Western blot检测显示BLAP75蛋白水平也随之降低，表明两种BLAP75 siRNA都能有效地沉默293T细胞中BLAP75基因的表达。
图 1 在293T细胞中用siRNA沉默BLAP75基因的表达
Figure 1. Silencing the expression of BLAP75 by siRNAs in 293T cells
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彗星图像如图 2所示，未照射组细胞均未显示出明显拖尾样彗星图像，而照射4 Gy和10 Gy的4组细胞都出现了明显的彗星拖尾现象，并且照射剂量越大彗星拖尾现象越明显，表明DNA损伤程度与IR存在剂量效应关系。通过CASP软件定量分析后，从表 1中可以看出4 Gy γ射线照射后，与未转染siRNA的293T细胞相比，转染BLAP75 siRNA1细胞的尾部DNA百分比、尾距和Olive尾距均显著增多（t=5.793，20.850，5.608，P均 < 0.05），并且在沉默BLAP75的该种细胞中重新表达野生型BLAP75之后接受照射，即BLAP75 siRNA1+BLAP75组细胞的尾部DNA百分比、尾距和Olive尾距又降回到正常293T细胞水平（t=0.957，0.352，0.814，P均 > 0.05）；在10 Gy照射下也发生同样趋势的变化。转染阴性对照Control siRNA的细胞与未转染siRNA的293T细胞相比，各指标差异却无统计学意义。表明在细胞中沉默BLAP75基因会增加IR诱导DNA的损伤，而回补BLAP75能有效减少该类DNA损伤，提示BLAP75蛋白参与IR诱导DNA损伤修复。
图 2 沉默BLAP75基因对电离辐射诱导DNA损伤的影响
Figure 2. Influences on the ionizing radiation-induced DNA damage after BLAP75 gene silence
组别 照射剂量/Gy 细胞数量/个 尾部DNA百分比/% 尾距 Olive尾距 293T 0 100 1.44±1.13 0.39±0.30 0.51±0.23 4 100 2.01±0.73 0.43±0.18 0.45±0.33 10 100 6.58±2.13 3.31±1.63 3.09±1.13 Control siRNA 0 100 0.90±0.42 0.18±0.10 0.70±0.25 4 100 2.39±0.17
（t=0.967）0.42±0.23
（t=0.355）0.47±0.33
（t=0.505）10 100 6.86±2.15
（t=0.757）3.29±2.73
（t=0.602）3.37±1.13
（t=0.302）BLAP75 siRNA1 0 100 1.36±0.74 0.19±0.09 0.28±0.13 4 100 6.58±2.13
（t=5.793）3.31±1.12
（t=20.850）3.09±2.08
（t=5.608）10 100 12.72±3.56
（t=12.060）9.07±2.03
（t=9.950）6.38±1.10
（t=4.392）BLAP75 siRNA1+BLAP75 0 100 1.08±0.45 0.20±0.08 0.72±0.22 4 100 2.20±0.78
（t=0.957）0.40±0.10
（t=0.352）0.38±0.03
（t=0.814）10 100 5.89±1.02
（t=0.773）2.97±0.98
（t=0.844）3.08±1.17
（t=0.682）注：表中，照射后Control siRNA细胞组、BLAP75 siRNA1+BLAP75细胞组与同等条件下未转染的293T细胞组进行比较，P均 > 0.05；BLAP75 siRNA1细胞组分别与同等条件下未转染的293T细胞组进行比较，P均 < 0.05。 表 1 沉默BLAP75基因对电离辐射诱导DNA损伤的量化
Table 1. Quantification of the ionizing radiation-induced DNA damage after BLAP75 gene silence
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将转染了不同siRNA的293T细胞用4 Gy或10 Gy射线照射后1 h，使用Western blot法检测细胞内3个代表性DNA损伤检查点的特征性蛋白磷酸化，即Chk2激酶的第68位苏氨酸、p53的第15位丝氨酸和H2AX的第139位丝氨酸的磷酸化情况。从图 3可见，IR照射后，阴性对照组（Control siRNA）细胞中Chk2的第68位苏氨酸被磷酸化，在沉默BLAP75基因的细胞中也是照射后此位点被磷酸化，并且磷酸化程度比Control siRNA组细胞增高；而p53的第15位丝氨酸的磷酸化变化则相反，尤其是在10 Gy照射后，在沉默BLAP75的细胞中的磷酸化程度比Control siRNA组细胞降低；H2AX的第139位丝氨酸的磷酸化也在10 Gy照射后有同样的变化，而与前两者不同的是，在未照射的沉默BLAP75细胞中该位点磷酸化程度明显高于对照细胞。这些特征性位点磷酸化的差异表明，BLAP75会影响IR引起的DNA损伤反应。
图 3 沉默BLAP75基因对DNA损伤反应中关键蛋白磷酸化的影响
Figure 3. Influences on the phosphorylation of key proteins in DNA damage response after BLAP75 gene silence
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IR诱导的DNA损伤类型以DSB为主，且DSB是最严重的DNA损伤形式之一，其主要通过非同源末端连接或者同源重组两条途径来修复[8]。由于BLAP75与BLM和TopoⅢα结合形成BLM-TopoⅢα-BLAP75（BTB）复合物，在HRR DSB过程中，具有催化BLM和TopoⅢα酶活性，从而促进HRR高效完成的重要作用[3]，所以BLAP75很可能在IR诱导的DNA损伤修复中发挥作用。本研究通过特异性的siRNA沉默293T细胞中BLAP75基因的表达，采用灵敏的单细胞凝胶电泳技术定量细胞的DNA损伤程度，发现沉默BLAP75的细胞在受到同样剂量γ射线照射后DNA损伤程度明显高于未转染siRNA的293T细胞和Control siRNA组细胞，而且在沉默BLAP75的细胞中重新表达抗siRNA的BLAP75能有效拯救此实验表型，表明在受到IR时BLAP75对DNA有重要的保护作用，或者具有快速修复受损DNA的作用。
细胞受到照射后DNA损伤反应是一个复杂的过程，DSB能启动多种信号通路，涉及的损伤识别因子主要有磷脂酰肌醇3-激酶：毛细血管扩张性共济失调症突变（ataxia telangiectasia-mutated，ATM）蛋白及ATM和Rad3相关蛋白（ATM and Rad3-related，ATR）等，它们将损伤信号传导到下游靶蛋白，最终导致细胞周期阻滞、DNA损伤修复或诱导细胞凋亡。因此，本研究还探索了可能在辐射损伤反应中与BLAP75相关的信号通路。IR诱导的DSB通常会激活ATM-Chk2信号通路[9]，所以，我们采用Chk2特异的磷酸化抗体检测Chk2上第68位苏氨酸的磷酸化程度，发现在细胞缺失BLAP75时，IR诱导Chk2的磷酸化程度比对照细胞增强，提示有BLAP75缺陷的细胞DNA修复能力可能下降，以致于积累了许多无法被修复的DNA损伤，导致更多的Chk2被激活。正常状态下p53蛋白水平很低，因为受到其特异性的负反馈调节因子鼠双微基因2（murine double，MDM2）的调节，MDM2是一种泛素化E3连接酶，它可直接与p53蛋白结合来促进p53蛋白的泛素化降解。当细胞中的DNA受到损伤时，p53蛋白被磷酸化，阻碍了MDM2的结合从而避免被降解，进而启动DNA修复机制，使损伤的DNA得以修复。因此，本研究也检测了p53蛋白的第15位丝氨酸的磷酸化程度，出人意料的是在沉默BLAP75的细胞中，IR导致的p53磷酸化程度却比对照细胞弱，暗示缺少BLAP75时可能也会引起p53的变化。另外，H2AX第139位丝氨酸磷酸化形成的γ-H2AX是DNA损伤的标志物，研究发现沉默BLAP75后即使未受到射线照射的细胞中γ-H2AX的水平也较高，分析原因可能是缺失BLAP75导致不能有效修复内源性的DNA损伤，造成DNA损伤的累积。
综上所述，本研究结果表明，BLAP75在IR诱导的DNA损伤反应中具有降低DNA损伤程度的重要生物学功能，提示BLAP75在辐射损伤修复中具有重要作用，具体的作用机制需进一步深入研究。
沉默BLAP75基因对电离辐射诱导DNA损伤的影响
Effects of silencing BLAP75 on DNA damage induced by ionizing radiation
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摘要:
目的 研究BLM结合蛋白75（BLAP75）在电离辐射诱导DNA损伤反应中的生物学效应。 方法 运用RNA干扰技术，在细胞中特异性沉默BLAP75基因，然后通过单细胞凝胶电泳技术来研究电离辐射诱导DNA损伤程度的变化，并且通过再次表达BLAP75来拯救沉默BLAP75所致的实验表型，以及应用Western blot方法研究DNA损伤反应中的磷酸化修饰。 结果 与未转染的293T对照组细胞相比，电离辐射在沉默了BLAP75基因的细胞中会诱导更多的DNA断裂，并且在此细胞中重新表达BLAP75则能降低DNA断裂数量至对照组细胞水平；γ射线照射后，细胞周期检查点激酶2（Chk2）的磷酸化程度比阴性对照组细胞增强。 结论 BLAP75能减少电离辐射诱导的DNA损伤，在电离辐射损伤修复中可能具有重要作用。 Abstract:Objective To study the biological effects of BLM-associated protein 75(BLAP75) in ionizing radiation(IR) induced DNA damage response(DDR). Methods BLAP75 was silenced in cells by RNA interference. Single-cell gel electrophoresis was performed to quantify the DNA breaks. Also siRNA-resistant BLAP75 was expressed in BLAP75-silenced cells to rescue the phenotype. Western blot was used to examine the DDR phosphorylation upon IR. Results IR induced more DNA breaks in BLAP75-silenced cells than in 293T control cells without siRNA transfection. After expression of BLAP75 in BLAP75-silenced cells, IR induced DNA breaks were similar to 293T control cells. In response to IR, the phosphorylation level of Chk2 was higher in the BLAP75-silenced cells than in the control cells. Conclusion BLAP75 alleviates IR-induced DNA damage and possibly plays an important role in IR-induced damage response and repair. -
Key words:
- Gene silencing /
- BLAP75 /
- Radiation, ionizing /
- RNA interference
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图 1 在293T细胞中用siRNA沉默BLAP75基因的表达
Figure 1. Silencing the expression of BLAP75 by siRNAs in 293T cells
图 2 沉默BLAP75基因对电离辐射诱导DNA损伤的影响
Figure 2. Influences on the ionizing radiation-induced DNA damage after BLAP75 gene silence
图 3 沉默BLAP75基因对DNA损伤反应中关键蛋白磷酸化的影响
Figure 3. Influences on the phosphorylation of key proteins in DNA damage response after BLAP75 gene silence
表 1 沉默BLAP75基因对电离辐射诱导DNA损伤的量化
Table 1. Quantification of the ionizing radiation-induced DNA damage after BLAP75 gene silence
组别 照射剂量/Gy 细胞数量/个 尾部DNA百分比/% 尾距 Olive尾距 293T 0 100 1.44±1.13 0.39±0.30 0.51±0.23 4 100 2.01±0.73 0.43±0.18 0.45±0.33 10 100 6.58±2.13 3.31±1.63 3.09±1.13 Control siRNA 0 100 0.90±0.42 0.18±0.10 0.70±0.25 4 100 2.39±0.17
（t=0.967）0.42±0.23
（t=0.355）0.47±0.33
（t=0.505）10 100 6.86±2.15
（t=0.757）3.29±2.73
（t=0.602）3.37±1.13
（t=0.302）BLAP75 siRNA1 0 100 1.36±0.74 0.19±0.09 0.28±0.13 4 100 6.58±2.13
（t=5.793）3.31±1.12
（t=20.850）3.09±2.08
（t=5.608）10 100 12.72±3.56
（t=12.060）9.07±2.03
（t=9.950）6.38±1.10
（t=4.392）BLAP75 siRNA1+BLAP75 0 100 1.08±0.45 0.20±0.08 0.72±0.22 4 100 2.20±0.78
（t=0.957）0.40±0.10
（t=0.352）0.38±0.03
（t=0.814）10 100 5.89±1.02
（t=0.773）2.97±0.98
（t=0.844）3.08±1.17
（t=0.682）注：表中，照射后Control siRNA细胞组、BLAP75 siRNA1+BLAP75细胞组与同等条件下未转染的293T细胞组进行比较，P均 > 0.05；BLAP75 siRNA1细胞组分别与同等条件下未转染的293T细胞组进行比较，P均 < 0.05。 
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