HE4重组抗原购自美国Fitzgerald公司；Na¹²⁵I是委托中国同位素公司代购美国PerkinElmer公司的产品；SP2/0骨髓瘤细胞和蛋白A亲和层析柱由天健生物制药有限公司提供（天津）；BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术公司；DMEM高糖培养基购买自美国Gibco公司；弗氏佐剂购自美国Sigma公司；羊抗鼠IgG及辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG购自美国Scanbody公司；Multiscan MK3型酶标仪为芬兰雷勃公司产品；紫外分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司产品；GC-911型γ计数放免分析仪为科大创新股份有限公司产品。

10只6周龄的BALB/C小鼠，将弗氏完全佐剂与HE4重组抗原乳化后进行腹腔注射，免疫剂量为50 μg/只。首次免疫后将弗氏不完全佐剂与HE4重组抗原乳化后进行腹腔注射，每2周进行1次加强免疫注射，免疫剂量为25 μg/只。加强免疫3次后，通过小鼠静脉采血，用ELISA法测定血清中抗体效价。当抗体效价达到1:50 000，于细胞融合前3 d时再进行1次加强免疫（小鼠进行腹腔注射，免疫剂量为50 μg/只）。

本实验室采用最新的标准细胞融合技术，选取抗体效价最好的小鼠，收集脾淋巴细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合（用低分子量的聚乙二醇诱导）。将融合后的杂交瘤细胞接种至96微孔细胞培养板上，对培养基中的杂交瘤细胞进行ELISA筛选。将筛选出的阳性杂交瘤细胞克隆于24孔培养皿上进行扩大培养。将确定为阳性的细胞克隆进行亚克隆以获得能产生抗体并进行稳定传代的细胞系。

用羊抗鼠IgG二抗包被96孔酶标板，在各孔中加入50 μl杂交瘤细胞培养液上清，并设立空白对照。37℃温育0.5 h后，再往各孔中分别加入50 μl HRP标记的兔抗鼠IgG，37℃温育30 min。洗板3次，加入100 μl 3, 3′, 5, 5′, -四甲基联苯胺（TMB）底物显色，加入终止液后用酶标仪测定其450 nm处的OD值。

针对每株杂交瘤细胞进行一次小批量的腹水生产（6只小鼠/株），用蛋白A层析柱从腹水样本中分离纯化单克隆抗体。通过紫外分光光度计测定抗体的浓度，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定抗体的纯度。

将0.05 mol/L、pH=7.2的PBS与胎牛血清配制成基础缓冲液，加入重组人HE4抗原，配制出浓度分别为0、30、80、200、500、1300 pmol/L的标准品。

配制pH =9.0的0.01 mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液；向其中加入HE4单克隆抗体，浓度为4 mg/L；将配制好的包被液按200 μl/管加入聚苯乙烯塑料管内；2~8℃放置24 h，倒掉液体，加入1.0 ml PBS洗管2次；200 μl/管封闭液（0.01 mol/L PBS，10 g/L BSA）2~8℃放置2 h后，将封闭液倒掉，晾干待用。

取1 μg/μl鼠抗人HE4单克隆抗体100 μl，加入3.7×10⁷ Bq的Na¹²⁵I，用磁力搅拌子边搅拌边加入氯胺T 30 μl（4.0 mg/ml）反应30 s；立即加入Na₂S₂O₃ 50 μl（4.0 mg/ml）反应20 s。用凝胶层析柱纯化分离，用PBS-BSA缓冲液配制标记物工作液，使100 μl标记物的每分钟放射性计数约为20万，2~8℃保存待用。

试剂盒上述主要组分制备完成以后，经过一系列的对比筛选试验，最终确定了HE4试剂盒的最佳操作方法和温育条件。

连续测定20管零标准品，将其每分钟放射性计数值做统计，求出其平均值（X）及标准偏差（SD），取X+2SD在标准曲线上所对应的浓度值即为本方法的分析灵敏度^[1]。

批内变异性：取低、高两个不同浓度的混合血清样品进行检测。每个样品做20管，计算测定浓度的X、SD，然后计算X/SD×100%，即为本方法的批内变异性；批间变异性：测定低、高浓度样品各10管，重复3次，计算3次测定的变异性。

取一定量的HE4抗原，将其溶解于人基础血清中，配制成高、中、低3个不同浓度的样品，用本方法测定其浓度，然后计算实际测定值与理论值之间的比例即为回收率。

采集200名正常人血清，用自制的HE4免放试剂盒测定其浓度，计算其X、SD，计算X+2SD即为正常参考值上限，小于该值即为正常^[1]。

测定120例用罗氏电化学发光试剂定值的卵巢癌患者血清样本，计算其阳性率；测定120名用罗氏试剂定值的正常人血清样本，计算其阴性率。并对测定结果进行对比分析。

通过对免疫小鼠血清抗体效价的测定，选取了1号、3号小鼠进行细胞融合，经阳性克隆筛选及亚克隆后，共获得了2株可以稳定分泌抗体的细胞株，分别命名为1A5和3D2，并对这两株细胞所分泌的抗体进行了亚型测定，结果显示均为IgG1型单抗。

将上述1A5和3D2细胞株分别接种6只BALB/C小鼠后，分别得腹水18.4 ml和20.7 ml，用蛋白A层析柱分离纯化后各得单克隆抗体66.3 mg和68.1 mg。用紫外分光光度计测定抗体的浓度分别为5.2 mg/ml和5.63 mg/ml。

将1A5和3D2两株单抗分别进行SDS-PAGE凝胶电泳（图 1），两株单抗的电泳结果均为两条带，相对分子质量分别为25 000的轻链和50 000的重链。经扫描图谱分析后计算得出两株单抗的纯度均＞95%。

图  1  纯化人附睾蛋白4单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图

Figure 1.  SDS-PAGE photo for purified human epididymis protein 4 monoclonal antibodies

经过一系列的筛选试验，最终确定本试剂盒的操作方法为：取100 μl标准品及血清标本加入包被试管，然后再加入100 μl ¹²⁵I标记的单抗工作液，室温振荡1 h，吸去管中液体，加入1 ml洗液洗管2次，然后再用γ计数器测定每管1 min内的放射性强度计数，测定结果如图 2所示，可以看出，2株HE4单克隆抗体配对结果较好，非特异性结合率低，标准品各点的结合率梯度拉差明显，标准曲线的线性良好。

图  2  人附睾蛋白4免疫放射分析法测定的标准曲线

Figure 2.  Standard curve of human epididymis protein 4 immunora-diometric assay

通过测定20管零标准品，得出本试剂盒的分析灵敏度为3.65 pmol/L。

通过对浓度分别为60、300 pmol/L的两个血清样本进行测定，计算出其批内变异性分别为5.31%和3.59%，其批间变异性分别为7.52%和5.17%。

通过对浓度分别为60、300和1200 pmol/L的3个血清样本测定，计算回收率分别为103.69%、102.64%和98.42%。

测定了200名正常人血清，计算浓度的X=98.43 pmol/L、SD=23.16、X+2SD=144.75 pmol/L。因此，确定本试剂盒测定的正常值范围为＜145 pmol/L。

通过对120例卵巢癌患者和120名正常人的血清样本的测定结果进行统计分析，本试剂盒的临床灵敏度可达90.83%、特异度为99.17%，基本接近罗氏电化学发光试剂盒的测定结果（表 1）。

卵巢癌是目前最常见也是病死率最高的妇科肿瘤之一，中国每年约每2万女性中就有1人被诊断为卵巢癌。因临床症状不明显，很易造成漏诊与误诊，近75%的卵巢癌患者确诊时已处于晚期并扩散到其他器官，错过了最佳治疗时机。如卵巢癌发展到后期扩散到其他腹部器官才确诊，患者的5年生存率仅为17%。如能在转移前得到诊断，患者的生存率可以达90%以上。目前卵巢癌的主要血清标志物是CA125，但其灵敏度、特异度并不理想。因此，探讨对卵巢癌更灵敏、特异度高的早期诊断指标是非常必要的。HE4在早期及中后期的卵巢癌诊断中的灵敏度均高于CA125，特异度也优于CA125^[2-3]。HE4与CA125联合应用，灵敏度可高达92%，可以减少30%~50%生物标志物阴性卵巢癌的漏诊，大大提高了卵巢癌诊断的准确率^[4-6]。

本研究制备了一对高亲和力、高特异度的HE4单抗，用其研制出了HE4免放试剂盒，并对其在卵巢癌检测中的临床灵敏度及特异度进行了测定分析。对120例卵巢癌患者血清和120名正常人血清样本的检测结果进行分析，其临床测定的灵敏度可达90.83%，特异度为99.17%，基本接近进口罗氏电化学发光试剂盒的测定结果，优于目前国内已报道结果^[7]。由于目前国内市场上的HE4被进口类产品所垄断，检测时需要有配套的大型仪器，且价格昂贵。本试剂盒与进口试剂相比，价格便宜，且操作方便快捷，对各型放免分析仪器完全开放，更适于在中小型医院及体检公司使用，可广泛应用于卵巢癌的早期诊断，有效提高卵巢癌的早期检出率，可做到早诊断早治疗，降低卵巢癌的病死率。