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各种放疗、化疗治疗肿瘤的主要作用机制之一是干扰肿瘤细胞DNA合成和抑制细胞分裂，诱导其发生凋亡，最终达到抑制或消除肿瘤的目的。1972年，Kerr等[1]科学家提出了细胞凋亡的概念。测定肿瘤细胞凋亡成为早期评价肿瘤疗效的指标之一。目前检测细胞凋亡的方法分为体外、体内两大类。体外检测技术开展较早，发展较成熟，但均属有创检查，并且通常只能在某一时间点进行凋亡检测，不能连续动态监测细胞凋亡在活体内的发生和发展过程，临床实际应用价值有限[2]。
放射性核素凋亡显像是目前研究最为广泛、技术最为成熟的体内细胞凋亡分子影像学检测技术。在肿瘤细胞凋亡领域，特异性分子探针的研发是显像的关键技术之一，其主要包括单光子显像剂和正电子显像剂，分别应用于SPECT和PET。
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Annexin V是一种内源性生理蛋白质，相对分子质量36 000。磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine，Ps）是构成细胞膜的磷脂成分，正常情况下主要靠移位酶和翻转酶维持其位于细胞膜内侧。在凋亡早期，这两种酶的失活及爬行酶的激活使Ps由细胞膜内侧移向外侧，暴露于细胞表面。在钙离子存在下，Annexin V可与细胞膜外的Ps快速而紧密地结合。由于Ps的外翻在细胞凋亡过程中出现的时间要明显早于可辨认的细胞形态学改变，因此能够早期检测细胞凋亡是此方法最大的优势之一。Kemerink等[3]对6名成年男性健康志愿者行99Tcm-联肼尼克酰胺-膜联蛋白V（99Tcm-hydrazinonicotinamide-Annexin V，99Tcm-HYNIC-Annexin V）显像，初步判断该显像剂安全且具有稳定的体内生物分布，显像剂主要分布于肾脏（49.7±8.1）%注射剂量（injected dose，ID），其次是肝脏（13.1±1.0）%ID、红骨髓（9.2±1.8）%ID和脾脏（4.6±1.6）%ID，其主要通过泌尿系统清除。Guo等[4]用99Tcm-Annexin V显像结合缺口末端原位标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）法检测荷EL4淋巴瘤模型在接受不同单剂量放疗前后肿瘤细胞凋亡情况，结果表明，放疗组肿瘤部位显像剂摄取率较对照组明显增高，增高程度与TUNEL的阳性率密切相关（r=0.892，P < 0.001）。Kartachova等[5]对33例恶性肿瘤患者早期放疗和（或）化疗前后肿瘤部位摄取99Tcm-HYNIC-rh-Annexin V程度进行研究，将结果分为0~3个等级，分别为无摄取（0级）、轻度摄取（1级）、中度摄取（2级）及高度摄取（3级），并将治疗前后肿瘤部位摄取显像剂程度的变化（△u）与实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）评价结果比较。除4例剔除病例外，15例完全缓解患者的△u增加1~3个级别；7例部分缓解患者的△u增加1~2个级别；而5例病情稳定患者的△u仅增加0~1个级别；2例病情进展患者甚至出现显像剂摄取程度降低的情况。因此，有效治疗后短时间内肿瘤部位显像剂摄取明显增加，而无效治疗摄取程度不变或降低。Kartachova等[6]进一步对16例非小细胞肺癌患者进行显像，得到相同结果。van de Wiele等[7]对20例头颈部鳞癌患者行99Tcm-HYNIC-rh-Annexin V凋亡显像，只有在缺乏坏死细胞的情况下，肿瘤组织对显像剂的摄取才与TUNEL结果相关。肿瘤细胞坏死发生早期，细胞膜的通透性明显增强，99Tcm-HYNIC-rh-Annexin V能迅速进入细胞内；在坏死晚期，细胞膜发生裂解，内层Ps暴露于细胞间质中，两种情况均可使99Tcm-HYNIC-rh-Annexin V与Ps紧密结合，从而干扰凋亡显像效果。因此，高特异性被凋亡细胞摄取的显像剂还需要不断去探索。
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Annexin B1是膜联蛋白家族的成员，由我国科学家孙树汉教授等[8-9]首次克隆成功。Annexin B1具有较强的钙依赖性磷脂结合活性，可以结合翻转到凋亡细胞表面的Ps。罗全勇等[10]用99Tcm-Annexin B1探测经化疗后的乳腺癌细胞MDA-MB-453，结果显示肿瘤细胞对99Tcm-Annexin B1的摄取与肿瘤细胞凋亡指数具有相关性（r=0.88，P < 0.01）。Annexin B1的氢基酸序列与Annexin V具有较高的同源性，并且三级结构非常相似。其体外检测细胞凋亡的能力甚至优于Annexin V[8-9]。
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C2A-谷胱甘肽S转移酶（C2A-glutathione S transferase，C2A-GST）是神经突触囊泡上具有重要功能的近膜胞质片段。在有钙离子存在时，C2A易与凋亡细胞外露的Ps结合。王峰等[11-12]采用99Tcm-C2A-GST对人H460非小细胞肺癌荷瘤裸鼠经紫杉醇化疗后进行显像，结合体外研究结果得出，化疗诱导前肿瘤摄取为（1.21±0.51）%ID/g，化疗后12、24、48 h肿瘤摄取分别为（2.82±0.90）%ID/g、（3.13±0.48）%ID/g和（3.52±1.81）%ID/g。苏木精-伊红染色法及TUNEL染色法显示，化疗后12、24、48 h每个高倍视野中的凋亡细胞率分别为（8.25±2.27）%、（34.43±4.73）%和（71.88±11.88）%。其可早期探测实体肿瘤化疗后的细胞凋亡，并且99Tcm-C2A-GST摄取量与凋亡指数呈直线相关，进而可用于早期预测和评价肿瘤疗效。
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耐久霉素是由19个氨基酸残基组成的生物活性多肽，可围绕磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanoIamine，PE）分子的头部以1:1比例高亲合，其特异性结合哺乳动物细胞膜上的PE。PE在哺乳动物细胞膜的磷脂中约占20%，主要分布在细胞膜内表面。细胞凋亡早期，PE可通过脂质双分子层外翻至细胞膜外与耐久霉素结合。Zhao等[13]研究发现，凋亡细胞对99Tcm-联肼尼克酰胺-耐久霉素（99Tcm-HYNIC-duramycin）的摄取量超过正常细胞的30倍。
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与SPECT显像相比，PET显像具有更高的灵敏度和空间分辨率，能够对生物分布和代谢过程进行定量分析，因此其用于肿瘤凋亡显像的研究越来越多。
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Zijlstra等[14]用18F-Annexin V对含有Ps成分的脂质体及经诱导的人T白血病Jurkat细胞结合实验证实，18F-Annexin V能够与含Ps成分的脂质体迅速而特异地结合，凋亡T淋巴细胞与18F-Annexin V的结合率比正常淋巴细胞高60%。Hu等[15]用18F-Annexin V PET探测荷瘤鼠经多柔比星化疗诱导的细胞凋亡，结果发现，PET能清晰显示化疗诱导凋亡情况的改变，化疗后3 d 18F-Annexin V的摄取达到峰值。Qin等[16]用18F-人重组膜联蛋白V（recombinant humanhis10-Annexin V，18F-Rh-His10-Annexin V）PET探测肺癌A549荷瘤裸鼠及肺癌VX2荷瘤兔经紫杉醇化疗诱导的凋亡，结果显示，诱导凋亡组摄取量较对照组增加。
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赵庆等[17]利用抗Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡模型，分别在体外和体内研究18F-SFB-Annexin B1的凋亡检测能力，结果表明18F-SFB-Annexin B1具有与Ps结合的生物活性。Wang等[18]研究显示，18F-SFB-Annexin B1主要经过泌尿系统迅速清除。18F-SFB-Annexin B1 PET/CT能清楚地探测到肿瘤化疗后诱导的细胞凋亡，在注射后2 h达到最佳的显像效果。
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Wang等[19]在VX2荷瘤兔化疗后72 h对其进行18F-C2A-GST PET凋亡显像，结果显示18F-C2A-GST与凋亡的肿瘤细胞结合，肿瘤化疗后SUVmax显著高于未化疗组；离体组织半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）活性及细胞凋亡指数与肿瘤对18F-C2A-GST的摄取量呈良好的正相关，18F-C2A-GST PET可能成为早期评价和预测肿瘤疗效的新方法。
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与多数分子探针相比，Aposense家族相对分子质量小，属于一种灵敏度高、特异性强的细胞凋亡检测剂。在人类肿瘤动物模型研究中，凋亡启动后，Aposense家族穿过质膜，聚集在凋亡细胞的细胞质内。Cohen等[20]设计了一种新型化合物5-氟代烷基-2-甲基-丙二酸（5-fluoropentyl-2-methyl-malonic acid，ML-10），相对分子质量206。18F-ML-10选择性集聚于凋亡细胞，坏死细胞基本不摄取，是首个应用于临床并在人体内进行显像的PET凋亡显像剂[21]，其在人体具有较理想的生物分布，安全、稳定、快速地分布于脏器，并且能够快速地被清除。Allen等[22]对10例脑转移瘤患者进行放疗前后早期研究显示，放疗后18F-ML-10摄取增加的程度与放疗结束后6~8周根据RECIST标准MRI所测得的肿瘤缩小率呈正相关。18F-ML-8也属于Aposense家族的一员，相对分子质量178。Yao等[23]研究报道，人肺腺癌细胞SPCA-1荷瘤裸鼠经环磷酰胺化疗后，18F-ML-8仅聚集在凋亡细胞的区域，结果经过体外检测和TUNEL检测验证，证明18F-ML-8可用于活体内肿瘤细胞化疗后的凋亡检测。18F-ML-8与18F-ML-10不同之处在于18F-ML-8有3个C单位组成侧链，18F-ML-10有5个C单位组成侧链，18F-ML-8能够更快地被体内组织摄取，血液及各种组织清除率更快。
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Caspase-3的活化是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。靛红磺胺基类小分子化合物是一类有效的Caspase-3抑制剂，在纳摩尔浓度水平能明显抑制Caspase-3的活性，其在凋亡细胞的摄取与Caspase-3明显相关[24]。Nguyen等[25]分别用环磷酰胺和birinapant（一种促凋亡的小分子化合物）处理多种肿瘤小鼠模型后进行PET显像，发现环磷酰胺化疗后18F-ICMT-11摄取高峰与离体检测的Caspase-3活性高峰时间一致。Caspase抑制剂特点为其不是Caspase-3选择性抑制，它们也能广泛抑制其他各种组织蛋白酶活性，因此凋亡显像特异度不高。
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DEVD是Caspase-3的酶切识别点的特异性氨基酸序列，以DEVD为核心的分子探针是Caspase-3的底物。在肿瘤模型研究中，荷瘤鼠化疗后行PET显像，结果显示肿瘤放射性摄取量与离体测定的Caspase-3活性相关，肿瘤放射性自显影与体外Caspase-3免疫组化染色结果相匹配[26-27]。Shen等[28]合成了含DEVD序列的18F-C-SNAT分子探针，其被Caspase-3切割后能发生环化及聚合反应而积聚在细胞内，荷HeLa肿瘤小鼠瘤内注射多柔比星治疗后，PET显像显示肿瘤内显像剂的摄取量较化疗前明显增高，化疗后肿瘤内Caspase-3活性明显增加，两者密切相关。Hight等[29]研究表明，18F-FB-VAD-FMK可用于评价治疗后肿瘤细胞凋亡情况，评价肿瘤的个体化疗效。张宝石等[30]和柳曦等[31]对含DEVD核心的小分子肽显像剂（18S，21S，24S，27S，30S）-27-（2-羧乙基）-21-（羧甲基）-30-（（2S，3R，4R，5R，6S）-6-（（2-（4-（3-[18F]氟戊基）-1H-1，2，3三唑-1-yl）乙酰氨基）甲基）-3，4，5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酰氨）-24-异丙基-18-甲基-17，20，23，26，29-五羰基-4，7，10，13-四氧-16，19，22，25，28-五氨杂三十烷-1，32-二酸（18F-FP-Peptide）的研究表明，A549肺癌凋亡细胞对标记具有特异性摄取，且摄取量与细胞的凋亡程度呈正相关。荷瘤鼠化疗后PET显像中肿瘤摄取量明显高于未化疗组，A549在检测肿瘤细胞凋亡方面有一定临床应用的潜在价值。
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细胞凋亡对评判肿瘤的疗效有非常重要的参考价值，尤其是对于早期疗效的评估。现有的显像剂大部分分子质量较大，血液清除较慢，早期显像效果不佳，且生产成本高，价格昂贵，标记方法较复杂。目前肿瘤凋亡显像剂主要应用于动物模型，真正应用于人体的凋亡显像剂种类并不多，研究样本量比较小，对于不同类型的肿瘤细胞凋亡结果的定性、定量判定缺乏明确的证据。怎样克服以上困难将是今后肿瘤细胞凋亡分子探针研究发展的方向，如何大量应用于人体也是亟待解决的问题，筛选特异度高、代谢快、剂量少、价格低廉的分子探针仍需要不断探索。
肿瘤细胞凋亡核素显像分子探针研究进展
Progress in molecular probes of radionuclide tumor apoptosis imaging
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摘要: 测定肿瘤细胞凋亡是早期评价肿瘤疗效的指标之一, 放射性核素凋亡显像是目前研究最为广泛、技术最为成熟的体内肿瘤细胞凋亡分子影像学检测技术, 能在活体内动态、无创地检测抗肿瘤治疗引起的细胞凋亡, 有助于肿瘤疗效的早期评判和预后分析, 其中特异性分子探针技术的研究开发是放射性核素凋亡显像的关键技术之一。笔者将目前有代表性的肿瘤细胞凋亡核素显像分子探针进行了总结。Abstract: Apoptosis is one of the important indices about the early assessment of the efficacy of tumor treatment. Among molecular imaging techniques of tumor apoptosis, radionuclide imaging is the most extensively studied and the most sensitive imaging modality, which can noninvasively and dynamically detect cell apoptosis induced by treatment in vivo, especially for efficacy of cancer therapies and prognosis of malignancies. Recently, as one of the key techniques, specific molecular probes are being developed. The representative molecular probes of the radionuclide imaging for tumor apoptosis are reviewed.
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Key words:
- Radionuclide imaging /
- Neolpasms /
- Apoptosis
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