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生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种骨髓造血功能衰竭症，是以全血细胞减少为主要表现的一种综合征[1]。近年来，对AA的机制研究已逐渐深入到分子生物学水平，动物模型的建立是研究其机制的基础。建立动物模型的方法主要包括物理、化学和免疫介导等，很多学者进行了多方面的探索和改进。本研究运用电离辐射及免疫介导在IRM-2小鼠中建立AA小鼠模型，在此基础上对AA小鼠模型的全血细胞、网织红细胞（reticulocyte，Ret）、骨髓及免疫学指标进行了检测，为AA的发病机理、药物筛选及防治研究提供了较好的动物模型。
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DBA/2近交系小鼠，雄性，5只，体重22~24 g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK（京）2005-0013；IRM-2近交系小鼠由我所培育[2-3]，雄性，30只，体重22~24 g，合格证号：SCXK（津）2005-0001。
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137Cs γ照射源（CAMMA-CELL40，加拿大原子能有限公司），照射剂量为6 Gy，剂量率为0.84 Gy/min；Coulter Ahra流式细胞仪购自美国Beckman公司；pocH-100i血细胞计数仪购自日本希森美康公司；RPMI-1640培养基、小牛血清均购自美国Gibco公司；异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠CD4抗体、藻红蛋白标记的兔抗鼠CD8抗体均购自美国Ebioscience公司。
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将IRM-2小鼠按体重分为3组，即对照组、照射组、AA模型组，每组10只，每组小鼠平均体重差异不能大于1，从而尽可能减少每组小鼠的生物差异性。其中，照射组和AA模型组小鼠接受6.0 Gy 137Cs γ射线一次性全身照射。
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处死DBA/2小鼠，取出胸腺，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液进行研磨，过滤，制成细胞浓度为5×106个/ml的单细胞悬液，经眼静脉丛注入照射后的IRM-2小鼠体内，0.2 ml/只。对照组和照射组注入等量的RPMI-1640培养液。
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照射后15 d，通过小鼠眼球取血200 μl，用血细胞计数仪测量外周血WBC、RBC、血小板数和血红蛋白（hemoglobin，HGB）含量。
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同1.5中的方法取血100 μl，用1%煌焦油蓝染色，在显微镜下计数Ret；取出小鼠单侧股骨，冲出骨髓，用血细胞计数仪测定BMNC。另取外周血，裂解红细胞后分别加入相应抗体进行避光孵育，用流式细胞仪检测CD4、CD8、CD40、CD80/86、B220等指标。
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所有数据处理采用SPSS16.0软件进行分析，统计结果以x±s表示，两组比较采用t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
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AA模型小鼠外周血各指标计数结果见表 1，由表可见，AA模型小鼠的WBC、RBC、HGB含量和血小板数均比对照组和照射组低，其中，与对照组和照射组比较，WBC、RBC和血小板数差异均有统计学意义（WBC：t=27.603、7.835，P均 < 0.05；RBC：t=6.841、6.016，P均 < 0.05；血小板：t=13.944、6.737，P均 < 0.05）；与对照组比较，HGB含量差异有统计学意义（t=5.063，P < 0.05）。
组别 只数 WB
（×109/L）RBC
（×1012/L）HGB
（g/L）血小板
（×109/L）对照组 10 8.23±0.41 10.24±0.91 149.7±11.6 1216.4±78.1 照射组 10 4.82±0.83 9.83±0.82 132.1±12.1 996.2±132.1 AA模型组 10 2.38±0.53 8.22±0.21 121.2±13.5 635.1±106.2 注：表中，AA：再生障碍性贫血；HGB：血红蛋白。 表 1 AA模型小鼠外周血各指标计数（x±s）
Table 1. The counts of peripheral blood indexes in aplastic anemia model(x±s)
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AA模型小鼠BMNC数和Ret百分比结果见表 2，由表可见，AA模型小鼠BMNC数和Ret百分比均比对照组和照射组低，且差异有统计学意义（BMNC：t=15.867、2.773，P均 < 0.05；Ret：t=6.245、3.084，P均 < 0.05）。
组别 只数 BMNC（×106/股骨） Ret（‰） 对照组 10 16.5±1.61 76.2±9.7 照射组 10 9.28±2.13 59.8±4.2 AA模型组 10 7.14±1.19 50.2±8.9 注：表中，AA：再生障碍性贫血；BMNC：骨髓有核细胞；Ret：网织红细胞。 表 2 AA模型小鼠骨髓有核细胞数和网织红细胞百分比（x±s）
Table 2. The count of BMNC and percentage of Ret in aplastic anemia model(x±s)
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AA模型小鼠外周血免疫学分型结果见表 3，由表可见，AA模型小鼠CD4+细胞比例低于对照组，差异有统计学意义（t=5.963，P < 0.05）；CD8+、CD40+、CD80+/86+细胞比例均高于对照组和照射组，且差异有统计学意义（CD8+：t=8.829、8.048，P均 < 0.05；CD40+：t=10.767、11.072，P均 < 0.05；CD80+/86+：t=6.988、9.241，P均 < 0.05）；B220+细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（t=2.172，P < 0.05）；CD4+/CD8+值低于对照组和照射组，差异有统计学意义（t=5.085、3.718，P均 < 0.05）。
组别 只数 CD4+（%） CD8+（%） B220+（%） CD4+/CD8+值 CD40+（%） CD80+/86+（%） 对照组 10 16.14±3.09 6.83±1.14 33.86±6.39 2.51±0.91 13.33±1.36 21.12±6.06 照射组 10 10.36±6.22 7.14±1.36 41.78±8.26 1.82±0.87 11.26±2.12 15.38±6.35 AA模型组 10 8.91±2.55 13.55±2.12 40.31±6.88 0.73±0.32 20.93±1.77 36.64±3.55 注：表中，AA：再生障碍性贫血。 表 3 AA模型小鼠外周血淋巴细胞亚群比例（x±s）
Table 3. The percentage of lymphocyte subsets in peripheral blood in aplastic anemia model(x±s)
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AA是一类以造血组织功能衰竭为特征的综合征[1, 4-5]，主要表现为骨髓造血功能低下及外周血全血细胞减少，AA具有治愈难、病势延缓的特点，目前认为该病的主要发病机制为造血干细胞减少或缺损、造血微环境损伤以及T淋巴细胞功能亢进。针对不同发病机制，建立AA动物模型，对于深入研究AA发病机制和选择有效的治疗靶点具有重要的临床意义。目前，先天性AA动物模型，诸如Fanc A-/-、Fanc C-/-、Fanc G-/-、Fanc D1-/-/Fanc 2-/-、Fanc D2-/-等小鼠及其他基因缺陷小鼠的AA模型较多[6]，而用电离辐射及免疫介导方法建立AA模型小鼠较少，本研究用该方法成功建立了AA模型小鼠。目前对AA动物模型评价的主要指标包括：全血细胞、Ret和骨髓象三系血细胞[1, 4]，本研究对AA模型小鼠全血细胞、Ret、BMNC的检测结果表明，AA模型组小鼠WBC、RBC、血小板数和HGB含量均低于对照组和照射组，BMNC数及Ret百分比显著下降，与对照组和照射组比较差异有统计学意义。本研究建立的AA模型小鼠，其外周血常规、Ret百分比和BMNC数等指标均符合AA动物模型的要求，与临床AA患者各项指标相符或相近，证明了本研究建立的AA动物模型是成功的。AA的发病机理除与造血干细胞本身缺陷、造血微环境损伤有关外，免疫功能异常也是一个重要的因素。CD4+细胞是具有辅助诱导性的T细胞亚群（Th），其增多表示B细胞产生的免疫球蛋白增多及细胞免疫力增强，CD8+是抑制性T细胞（Ts）中的细胞毒性T细胞（Tc）亚群，其增多表示免疫抑制；CD4+/CD8+值表示Th与Ts之间的功能平衡状态，是人体免疫系统内环境稳定的重要指标，该比值降低可引起机体免疫功能紊乱。AA患者的外周血CD4+细胞比例降低，CD8+细胞比例升高，CD4+/CD8+值失调；本研究结果表明，AA模型小鼠CD4+细胞比例低于对照组，CD8+细胞比例高于对照组，CD4+/CD8+值失调，这与临床上AA患者的情况基本相符[5-6]。T细胞活化相关的共刺激分子CD40+、CD80+/86+等也参与了AA的发病过程，CD40+属于肿瘤坏死因子受体超家族，其表达异常是AA患者免疫功能紊乱的原因之一；CD80+/86+分子表达于抗原提呈细胞上，并介导了对AA患者造血机能的破坏。本研究中AA模型小鼠CD40+、CD80+/86+细胞比例高于对照组和照射组，表明体液免疫和细胞免疫都可能增强并参与AA的发生，这与临床对AA患者的研究结果相符[7-9]，从结果可以看出，本研究建立的AA模型小鼠的BMNC数、Ret百分比、外周血及分型等指标的变化与人类AA患者各项指标相符或相近，说明本研究成功构建了AA动物模型，对AA的研究具有较好的应用价值。
免疫诱导IRM-2小鼠再生障碍性贫血模型的研究
Immune-induced aplastic anemia IRM-2 mice model research
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摘要:
目的 建立IRM-2小鼠再生障碍性贫血(AA)实验动物模型, 并检测其血液及相关免疫学指标。 方法 IRM-2小鼠经137Cs γ射线6 Gy照射后, 输入DBA/2小鼠的胸腺细胞, 建成免疫介导型AA模型。实验分3组, 即对照组、照射组和AA模型组, 于照射后第15天检测小鼠的血常规和免疫学指标。 结果 IRM-2小鼠AA模型组外周血WBC、RBC、骨髓有核细胞数和网织红细胞百分比分别为(2.38±0.53)×109/L、(8.22±0.21)×1012/L、(7.14±1.19)×106/股骨和(50.2±8.9)‰, 均低于对照组[(8.23±0.41)×109/L、(10.24±0.91)×1012/L、(16.5±1.61)×106/股骨和(76.2±9.7)‰]; IRM-2小鼠AA模型组免疫学指标中CD4+细胞比例[(8.91±2.55)%]低于对照组[(16.14±3.09)%], CD8+细胞比例[(13.55±2.12)%]高于对照组[(6.83±1.14)%]。IRM-2小鼠AA模型组外周血及免疫学指标与对照组比较, 差异均具有统计学意义。 结论 IRM-2小鼠AA动物模型的建立, 对AA的研究具有较好的应用价值。 Abstract:Objective To perform traditional blood and immunologic examinations for the pathogenesis of immune-induced aplastic anemia(AA) IRM-2 mice model. Methods IRM-2 mice were divided into three groups, namely, the control, radiation, and AA model groups. IRM-2 inbred mice in the AA model group were used to set up the AA model by whole body 137Cs γ irradiation and eye venous plexus injection with DBA/2 mice thymus cells. After 15 days of radiation, blood and bone marrow cells were counted, and immunologic detection was performed. Results The peripheral WBC, RBC, bone marrow cells, and reticulocyte[(2.38±0.53)×109/L, (8.22±0.21)×1012/L, (7.14±1.19)×106/femur, and(50.2±8.9)‰] in the AA model group were lower than those of the control group [(8.23±0.41)×109/L, (10.24±0.91)×1012/L, (16.5±1.61)×106/femur, and(76.2±9.7)‰]. CD4+ cells [(8.91±2.55)%] of the AA model group were lower than those of the control group[(16.14±3.09)%], whereas CD8+ cells [(13.55±2.12)%] were higher than those of the control group [(6.83±1.14)%]. Peripheral blood and immunological indexes of the AA model group were statistically different from those of the control group. Conclusion IRM-2 mice AA model was successfully established as a good model for the study of AA. -
Key words:
- Anemia, aplastic /
- Models, animal /
- Immune induction /
- Evaluation studies
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表 1 AA模型小鼠外周血各指标计数（x±s）
Table 1. The counts of peripheral blood indexes in aplastic anemia model(x±s)
组别 只数 WB
（×109/L）RBC
（×1012/L）HGB
（g/L）血小板
（×109/L）对照组 10 8.23±0.41 10.24±0.91 149.7±11.6 1216.4±78.1 照射组 10 4.82±0.83 9.83±0.82 132.1±12.1 996.2±132.1 AA模型组 10 2.38±0.53 8.22±0.21 121.2±13.5 635.1±106.2 注：表中，AA：再生障碍性贫血；HGB：血红蛋白。 
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表 2 AA模型小鼠骨髓有核细胞数和网织红细胞百分比（x±s）
Table 2. The count of BMNC and percentage of Ret in aplastic anemia model(x±s)
组别 只数 BMNC（×106/股骨） Ret（‰） 对照组 10 16.5±1.61 76.2±9.7 照射组 10 9.28±2.13 59.8±4.2 AA模型组 10 7.14±1.19 50.2±8.9 注：表中，AA：再生障碍性贫血；BMNC：骨髓有核细胞；Ret：网织红细胞。
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表 3 AA模型小鼠外周血淋巴细胞亚群比例（x±s）
Table 3. The percentage of lymphocyte subsets in peripheral blood in aplastic anemia model(x±s)
组别 只数 CD4+（%） CD8+（%） B220+（%） CD4+/CD8+值 CD40+（%） CD80+/86+（%） 对照组 10 16.14±3.09 6.83±1.14 33.86±6.39 2.51±0.91 13.33±1.36 21.12±6.06 照射组 10 10.36±6.22 7.14±1.36 41.78±8.26 1.82±0.87 11.26±2.12 15.38±6.35 AA模型组 10 8.91±2.55 13.55±2.12 40.31±6.88 0.73±0.32 20.93±1.77 36.64±3.55 注：表中，AA：再生障碍性贫血。
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