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耐辐射菌属(Deinococcus)是已发现的最耐辐射的微生物,是众所周知的能够耐受多重压力的球菌或杆状非孢子菌,其高效的DNA损伤修复的能力是已知的其他细菌无法比拟的[1]。耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是由美国科学家Anderson等[2]于1956年在经X射线灭菌后仍然变质的牛肉罐头中首次发现的,其对电离辐射、紫外辐照、干燥以及其他造成DNA双链断裂的理化因素均具备超乎寻常的抵抗能力[3-4]。研究发现,pprI基因(pleiotropic gene promoting DNA repair)的功能是作为一个辐射响应调控的总开关[5],而pprM基因可能是依赖于pprI基因的一个调节子,并证实pprM基因缺陷菌株表现出对电离辐射较高的敏感性[6]。通过对PprM蛋白进一步的生物信息学分析发现,该蛋白既含有RNA结合结构域,又拥有冷休克DNA结合域(cold-shock DNA-binding domain)。PprM蛋白同时拥有RNA和DNA结合的特性在已知的DR蛋白中是非常罕见的,提示该蛋白在DR辐射抗性方面可能起着重要的调控作用。但目前有关pprM基因功能的研究尚少,具体的调控途径仍不清楚。
本研究拟在前期构建的pprM基因敲除株的基础上,利用PCR方法在pprM基因的C末端携带HA(流感病毒血凝素)标签,并连接到pRADK质粒上,再转化到pprM基因敲除株中,得到pprM基因敲除回补株,为后期研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA筛选奠定良好的基础。
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Deinococcus radiodurans R1(编号:CGMCC 1.633)由南华大学公共卫生学院核辐射DNA损伤与修复实验室传代并保存,购自中国普通微生物菌种保藏中心;pprM基因缺失株、大肠杆菌DH5α由南华大学公共卫生学院核辐射DNA损伤与修复实验室保存;pRADK质粒由浙江大学农业与生物技术学院华跃进教授馈赠。
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限制性内切酶NdeⅠ、T4 DNA连接酶购自美国Fermentas公司;Pfx高保真DNA聚合酶购自美国Invitrogen公司;质粒提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker、抗HA标签兔多克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司;引物合成、基因测序由苏州金唯智生物技术有限公司完成。
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以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体作为模板,设计并合成带HA标签的引物对,序列为P1:5′-GGGTATAC(NdeⅠ酶切位点)GTGTGCCGAGTTTC-3′;P2:5′-CTCATATG(NdeⅠ酶切位点)GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTA(HA标签序列)-CCAGCGGTCGTCGGG-3′。采用Pfx高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,反应体系见表 1。扩增条件如下:94℃ 2 min;94℃ 45 s、59℃ 30 s、72℃ 90 s,共30个循环;72℃延伸10 min。
反应成分 体积(μl) 10×Pfx buffer 5.0 10×PCRx buffer 2.5 MgSO4(50 mmol/L) 1.0 dNTP(10 mmol/L) 1.0 P1(10 mmol/L) 1.5 P2(10 mmol/L) 1.5 pGEX-6p-1-pprM载体 2.0 Pfx高保真DNA聚合酶 1.0 ddH2O 34.5 总体积 50 表 1 PCR扩增的反应体系
Table 1. PCR reaction system
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后进行切胶回收,按普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒中的说明进行回收和纯化。将获得的PCR产物送往苏州金唯智生物技术有限公司进行测序。提取质粒载体pRADK。将PCR产物与pRADK质粒用NdeⅠ酶切,酶切体系:PCR产物或pRADK质粒25 μl,10×buffer R 5 μl,NdeⅠ 2 μl,加ddH2O至50 μl。酶切条件:37℃,水浴酶切3 h。将载体与目的片段的单酶切产物进行连接,连接体系:T4 DNA连接酶1 μl,10×Ligation Buffer 1 μl,pRADK质粒1 μl,HA-pprM 4 μl,加ddH2O至10 μl。连接条件:16℃,过夜连接。取5 μl的连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,于含30 μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选。挑取平板上的单克隆菌落接种到5 ml含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基中,于37℃过夜摇培,再提取质粒,质粒经NdeⅠ酶切验证,阳性克隆子送苏州金唯智生物技术有限公司测序。
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DR新鲜感受态细胞的制备和转化采用改良的CaCl2法[7],简要操作步骤如下:挑取DR单菌落,接种于TGY液体培养基中,30℃振荡培养过夜以活化菌种;第2天取适量菌液转接于10 ml新鲜TGY(tryptone-glucose-yeast)液体培养基中,培养至OD值约0.8,然后分装到1.5 ml离心管中,每管1 ml,4℃,3500×g离心5 min收集菌体;加入1 ml无菌CaCl2溶液(配方:2×TGY培养基、50 mmol/L CaCl2溶液),4℃,3500×g离心5 min收集菌体,并重复一次。加入0.5 ml无菌CaCl2溶液,30℃振荡培养90 min;取出离心管至冰上冷却2 min,然后加入需要转化的质粒10 μl,轻轻混匀后于冰上静置45 min;将离心管中的菌液转移至5 ml TGY液体培养基中,30℃振荡培养18 h;取100 μl菌液涂布于含30 μg/ml卡那霉素的营养肉汁固体培养基上。
挑取阳性克隆至5 ml含30 μg/ml卡那霉素的TGY液体培养基中,30℃振荡培养约20 h。采用生物辐照仪(中国核动力研究设计院设备制造厂)予以2 kGy辐照,收集细菌。加入5 ml新鲜TGY液体培养基,30℃振荡培养约2 h。将菌液置于冰上用美国Sonics超声波细胞破碎仪破碎,超声10 s,间歇10 s,共超声30次,超声输出振幅15%。13 000×g离心10 min,吸取上清用于Western blot检测。
耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定
Construction and identification of pprM-complemented Deinococcus radiodurans strain
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摘要:
目的 构建耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株, 为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础。 方法 设计并合成HA-pprM基因(HA为流感病毒血凝素)全长的引物, 以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板, PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长, 经NdeⅠ酶切后, 与pRADK载体连接并转化大肠杆菌, 经培养、提取质粒及纯化后, 采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性; 采用CaCl2法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中, 通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。 结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小(438 bp), 测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致, Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13000。 结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM, 为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础。 Abstract:Objective To investigate the function of PprM protein by constructing a pprM-complemented strain of Deinococcus radiodurans. Methods HA-pprM gene was amplified by PCR from the plasmid DNA of pGEX-6p-1-pprM(approximately 438 bp) and then inserted into the shuttle expression vector pRADK to construct pRADK-HA-pprM. The correctness of the inserted sequences was confirmed through agarose gel electrophoresis, restriction enzyme digestion, and gene sequencing. The recombinant plasmid was transformed into the pprM mutant strain of Deinococcus radiodurans, and the recombinant protein was analyzed by Western blot. Results The recombinant plasmid pRADK-HA-pprM and a complemented strain were obtained. The recombinant protein can be highly expressed in the complemented strain. Conclusion This study provided a foundation for further studies on the interaction between the PprM protein and its target DNA. -
Key words:
- Deinococcus /
- pprM gene /
- Complemented strain construction
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表 1 PCR扩增的反应体系
Table 1. PCR reaction system
反应成分 体积(μl) 10×Pfx buffer 5.0 10×PCRx buffer 2.5 MgSO4(50 mmol/L) 1.0 dNTP(10 mmol/L) 1.0 P1(10 mmol/L) 1.5 P2(10 mmol/L) 1.5 pGEX-6p-1-pprM载体 2.0 Pfx高保真DNA聚合酶 1.0 ddH2O 34.5 总体积 50 -
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