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随着核工业系统相关产业的快速发展，职工接触放射性等职业危害因素的机会增加。通过对核工业某厂职业人员的健康调查发现，放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变率和微核细胞率与非放射工作人员没有明显差异。虽然染色体畸变是生物剂量剂的金标准，但是染色体畸变和微核检查的灵敏度限制了其在放射工作人员健康调查中的应用。
电离辐射诱发的基因表达变化与被照射细胞及生物体的生物学反应密切相关。电离辐射作为一种物理损伤因素，通过使细胞内的水分子电离产生自由基或直接损伤DNA等靶分子，并以此作为信号分子，再通过转录或转录后激活，诱导一系列基因表达和生化级联反应，最终引起细胞结构和功能的改变，导致细胞周期休止、细胞转化和凋亡等改变[1-3]。因此，辐射诱导的基因表达变化将为辐射损伤评价提供新的研究思路和方法[4-5]。
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外周血总RNA提取试剂盒RNAprep pure（天根生化科技有限公司，北京）；反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）（宝生物工程有限公司，大连）；Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪（Corbett Life Science公司，澳大利亚）。
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选择近期无放射性物质接触史的3名健康男性为供血者，年龄24~29岁，在无菌条件下静脉取血9 ml，分装到9个乙二胺四乙酸抗凝管中，备用。
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采用中国辐射防护研究院附属医院60Co治疗机进行γ射线照射，照射剂量率为0.313 Gy/min，照射剂量分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2.0 Gy，误差范围为±0.3%，源皮距80 cm，照射野20 cm×20 cm，照射完后于37℃静置培养2 h。
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外周血样品取自核工业某厂96名职工，其中，49名为放射工作人员，47名为非放射工作人员。在无菌条件下每人抽取外周血1 ml到乙二胺四乙酸抗凝管中，期间反复轻轻摇动，防止凝血。
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采用外周血总RNA提取试剂盒提取总RNA，获得的总RNA直接用于cDNA的合成。
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采用反转录试剂盒完成cDNA的合成，cDNA合成的反转录反应体系为：5×PrimeScript Buffer 4 μl，总RNA 16 μl，反应体系总体积为20 μl。反转录反应条件为：37℃，15 min（反转录反应）；85℃，5 s（反转录酶的失活反应）。
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本实验中目的基因为人鼠双微体基因2（murine double minute 2，MDM2），所选内参基因为人β-actin基因。MDM2基因全序列来自GeneBank，实时荧光定量PCR的引物序列设计见表 1，序列合成委托宝生物工程（大连）有限公司合成。
基因名称 引物序列（5’→3’方向） MDM2 上游引物：ATCTACAGGGACGCCATCGAA 下游引物：TGAAACTGAATCCTGATCCAACCA β-actin 上游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA 下游引物：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 注：表中，MDM2：鼠双微体基因2。 表 1 实时荧光定量PCR引物设计
Table 1. The primers for real time fluorescent quantitation PCR
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利用实时荧光定量PCR仪，采用Comparative Delta-delta Ct法，以看家基因β-actin作为内参，相对定量照射后样品靶基因的表达水平。实时荧光定量PCR的反应体系为：SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5 μl、cDNA 2~2.5 μl、PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μl、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μl，放入ddH2O至反应总体积为25 μl。反应条件为：95℃，10 s（1个循环）；95℃，5 s，60℃，20 s（40个循环）。
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数据以x±s表示，采用SPSS统计学软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
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计算3名志愿者离体外周血经照射后在每个剂量点其MDM2基因相对表达量（其中，MDM2基因相对表达量＝MDM2 mRNA/β-actin mRNA），然后对3名志愿者离体外周血MDM2基因表达水平进行统计分析，结果见表 2。
照射剂量（Gy） 相对表达量 0 1 0.05 1.14±0.15 0.1 1.39±0.14 0.2 2.28±0.22 0.4 2.02±0.18 0.6 2.07±0.15 0.8 1.93±0.20 1.0 2.72±0.10 2.0 3.49±0.22 注：表中，MDM2：鼠双微体基因2。 表 2 照射后各个剂量点的MDM2基因相对表达量
Table 2. Relative expresstion level of MDM2 at different radiation dose
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将不同剂量点的MDM2基因表达水平通过Origin分析软件分析，得到电离辐射后MDM2基因表达变化规律（图 1），由图可见，MDM2基因表达水平随着照射剂量的增加呈现上升的趋势。
图 1 电离辐射后鼠双微体基因2表达水平的变化
Figure 1. The change of gene expression of murine double minute 2 exposed to ionizing radiation
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对非放射工作人员不同年龄段人群外周血MDM2基因表达进行单因素方差分析，结果表明，非放射工作人员不同年龄段人群的外周血MDM2基因表达水平分布均衡，差异无统计学意义（F=2.11，P＞0.05）（表 3）。
年龄（岁） 人数 平均年龄（岁） MDM2基因表达水平 20~29 13 25.46±1.71 1.38±0.81 30~39 10 37.50±1.35 0.79±0.38 40~50 24 43.25±3.00 1.40±0.96 注：表中，MDM2：鼠双微体基因2。 表 3 非放射工作人员不同年龄段人群外周血MDM2基因表达水平比较
Table 3. Comparison of MDM2 gene expression in peripheral blood of non-radiation-exposed workers among different age groups
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对非放射工作人员不同性别人群外周血MDM2基因表达水平与性别的相关性进行研究，其中，男性组24人、女性组23人，结果发现男性组MDM2基因的平均表达量为0.92±0.22，女性组MDM2基因的平均表达量为0.75±0.35，说明MDM2基因表达水平与性别无关（t=2.35，P＞0.05）。
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对放射工作人员和非放射工作人员外周血MDM2基因表达水平进行统计学t检验，其中放射工作人员组基因表达平均水平为1.00±0.18，非放射工作人员基因表达平均水平为1.58±0.21，结果表明，两者外周血MDM2基因的表达水平差异具有统计学意义（t=7.78，P＜0.05）。
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MDM2基因位于人染色体Dq14.3~15[6]，最初发现于一种致瘤性小鼠成纤维细胞中，后来发现其在人体和小鼠的正常组织中广泛地表达，表明其可能与细胞的生理功能密切相关。电离辐射可以通过诱发p53基因激活导致DNA损伤，而MDM2是p53的下游基因，p53蛋白可作为转录因子调控其下游MDM2基因表达，因此，电离辐射对MDM2的基因表达能产生一定的影响[7-8]。
本研究采集了3名健康人的离体外周血进行60Co γ射线照射，以β-actin作为内参基因，探索辐照后MDM2基因表达的剂量-效应关系。初步的实验结果表明，在0~2 Gy剂量范围内，MDM2的mRNA相对表达水平随照射剂量的增加而呈现上升趋势，具有剂量依赖性。进一步收集并完成了核工业某厂49名放射工作人员与47名非放射工作人员的生物样品检测，结果发现MDM2基因表达水平与年龄、性别等因素无关，放射工作人员和非放射工作人员的MDM2基因表达水平差异具有统计学意义。
随着分子生物学技术的发展，国内学者已开展了大量分子水平辐射生物效应的研究，部分学者以人外周血淋巴细胞为研究对象进行了大量辐射敏感基因的筛选，但分子生物学检测指标在核工业放射工作人员中的应用研究鲜有报道，所以有必要深入研究基因表达作为检测指标在核工业放射工作人员的健康检查中的可行性。
本研究将前期离体外周血筛选出的敏感基因检测指标试用于核工业放射工作人员的健康体检，结果发现，放射工作人员和非放射工作人员的MDM2基因表达水平差异具有统计学意义，这是本研究的一个亮点，但目前还不能作为常规手段应用于核工业健康调查中，还需要进行进一步的现场验证。
核工业某厂放射工作人员与非放射工作人员的MDM2基因表达调查与分析
Investigation and analysis of MDM2 expression level in radiation-exposed workers and non-radiation-exposed workers
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摘要:
目的 探讨核工业某厂放射工作人员与非放射工作人员辐射敏感基因表达的差异。 方法 采集了3名健康人外周血进行60Co γ射线照射，建立辐照后鼠双微体基因2（MDM2）表达的剂量-效应关系，抽取核工业某厂96名工作人员（49名放射工作人员、47名非放射工作人员）外周血，利用实时荧光定量PCR技术检测放射工作人员外周血中MDM2基因的表达情况。 结果 在0~2 Gy剂量范围内，MDM2的表达水平随照射剂量增加而上升。某厂96名工作人员外周血MDM2基因表达水平的检测分析结果表明，非放射工作人员年龄因素对外周血MDM2基因表达无影响（F=2.11，P＞0.05）；放射工作人员外周血MDM2基因表达与非放射工作人员相比，差异具有统计学意义（t=7.78，P＜0.05）。 结论 电离辐射可以诱导人离体外周血MDM2基因表达改变，且基因表达与照射剂量存在一定的剂量相关性，MDM2有望成为核工业放射工作人员健康调查的敏感指标。 Abstract:Objective To investigate the difference of radiation-sensitive gene expression between radiation-exposed and non-radiation-exposed workers in a nuclear industry factory. Methods Peripheral blood samples from 3 healthy volunteers were exposed to 60Co γ-rays at different doses. Exposure of murine double minute 2(MDM2) mRNA expression to ionizing radiation was observed. MDM2 gene expression levels were detected in peripheral blood from 96 workers(i.e., 49 radiation-exposed workers and 47 non-radiation-exposed workers) in a nuclear industry factory by using real-time PCR. Results The MDM2 expression levels of peripheral blood samples from 3 healthy volunteers exposed to 60Co γ-rays increased with an increased dose of 0 Gy to 2 Gy. Moreover, the relationship between the ratio of MDM2 mRNA/β-actin and irradiation dose represents certain line correlation, which was fit by Origin 7.5 software. The detection and analysis results of MDM2 gene expression levels in nuclear factory workers showed no statistically significant difference between different age groups and MDM2 gene expression levels in the peripheral blood of non-radiation-exposed equilibrium distribution of staff(F=2.11, P>0.05). Therefore, age factor had no effect on MDM2 gene expression. The MDM2 gene in the peripheral blood of radioactivity staff was statistically significant to radiation-exposed workers(t=7.78, P < 0.05). Conclusions Ionizing radiation can induce changes in gene expression from human peripheral blood, and this process is dose-related. MDM2 gene expression levels may be a new radiosensitive index in health examination survey in the future. -
Key words:
- Radiation, ionizing /
- Gene expression /
- Health surveys /
- Murine double minute 2 gene /
- Peripheral blood
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图 1 电离辐射后鼠双微体基因2表达水平的变化
Figure 1. The change of gene expression of murine double minute 2 exposed to ionizing radiation
表 1 实时荧光定量PCR引物设计
Table 1. The primers for real time fluorescent quantitation PCR
基因名称 引物序列（5’→3’方向） MDM2 上游引物：ATCTACAGGGACGCCATCGAA 下游引物：TGAAACTGAATCCTGATCCAACCA β-actin 上游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA 下游引物：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 注：表中，MDM2：鼠双微体基因2。 
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表 2 照射后各个剂量点的MDM2基因相对表达量
Table 2. Relative expresstion level of MDM2 at different radiation dose
照射剂量（Gy） 相对表达量 0 1 0.05 1.14±0.15 0.1 1.39±0.14 0.2 2.28±0.22 0.4 2.02±0.18 0.6 2.07±0.15 0.8 1.93±0.20 1.0 2.72±0.10 2.0 3.49±0.22 注：表中，MDM2：鼠双微体基因2。
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表 3 非放射工作人员不同年龄段人群外周血MDM2基因表达水平比较
Table 3. Comparison of MDM2 gene expression in peripheral blood of non-radiation-exposed workers among different age groups
年龄（岁） 人数 平均年龄（岁） MDM2基因表达水平 20~29 13 25.46±1.71 1.38±0.81 30~39 10 37.50±1.35 0.79±0.38 40~50 24 43.25±3.00 1.40±0.96 注：表中，MDM2：鼠双微体基因2。
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[1] 周学平, 王红阳, 杨广顺, 等. MXR7基因的克隆及其在人正常和肿瘤组织中的表达[J].中华实验外科杂志, 1999, 16(2): 144-146. doi: 10.3760/j.issn:1001-9030.1999.02.023
[2] 方宁波, 李勇. MXR7基因与原发性肝癌关系的研究进展[J].南昌大学学报:医学版, 2013, 53(5): 97-100.
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