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电离辐射可导致炎症因子IL-1β的高表达，促进细胞或机体的炎症反应。而IL-1β的分泌与细胞中Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症复合体相关[1]。NLRP3蛋白复合体是近年来发现的炎症复合体，该复合体是启动固有免疫反应的主要功能单位。NLRP3一旦被危险信号激活，该复合体就会切割IL-1β前体使之转化为成熟的细胞因子IL-1β，从而导致炎症反应[2]。沉默信息调节因子1（silence information regulator-1，SIRT1）可以通过对炎性相关转录因子进行去乙酰化加工抑制NLRP3的表达，进而抑制IL-1β的表达，实现抗炎抗凋亡的作用。白藜芦醇是SIRT1的天然激活剂，对炎症性疾病表现出良好的治疗前景[3]。本研究探索了白藜芦醇通过SIRT1和NLRP3途径在辐射诱导产生的炎症中的调节作用，为辐射防护药物的开发提供新的方向和思路。
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DMEM/F12培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；白藜芦醇购自德国Sigma公司，溶于二甲基亚砜（购自天津市江天化工科技有限公司）中，储液浓度为50 mmol/L；Human IL-1β Quantikine酶联免疫吸附测定试剂盒购自美国R & D Systems公司；实验所用抗体为兔抗人IL-1β抗体、鼠抗人β-肌动蛋白抗体，均购自英国Abcam公司；PrimeScript RT试剂盒及BCA（bicinchoninic acid）蛋白定量试剂盒购自日本Takara公司；RNA干扰慢病毒载体由上海生工生物工程股份有限公司合成；人间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由细胞产品国家工程研究中心赠送。137Cs γ射线照射源由加拿大原子能公司生产（型号USD），剂量率为0.873 Gy/min。
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用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养MSCs。实验共分5组，其中，空白对照组：不作处理；单纯照射组：给予细胞4 Gy照射；RNA干扰组：采用慢病毒载体pGCSIL-GFP（其中，GFP为绿色荧光蛋白）将SIRT1短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）转染入细胞（正义引物：5′-CCGGGCGGGAATCCAAAGGATAATTCTCGAGAATTATCCTTTGGATTC-CCGCTTTTTG-3′；反义引物：5′-AATTCAAAAAG-CGGGAATCCAAAGGATAATTCTCGAGAATTATCC-TTTGGATTCCCGC-3′）；白藜芦醇组：给予细胞200 μmol/L的白藜芦醇作为阳性对照；RNA干扰+白藜芦醇组：使用慢病毒载体将SIRT1 shRNA转染入细胞，再给予细胞200 μmol/L的白藜芦醇。当细胞生长至对数生长期时进行实验，SIRT1 shRNA转染48 h后，对各组细胞进行4 Gy照射，并在照射前1 h预先给予200 μmol/L白藜芦醇，照射后24 h提取细胞培养液上清、细胞总蛋白和总RNA。
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严格按照Human IL-1β Quantikine酶联免疫吸附测定试剂盒中说明书的方法进行操作。取200 μl细胞培养液上清，加入至包被好IL-1β的96孔板中，孵育2 h后，弃培养液，再加入200 μl IL-1β偶联物，孵育1 h后，再弃去。加入200 μl底物溶液，避光孵育20 min后，加入50 μl终止液，于450 nm处检测吸光度值，通过绘制标准曲线，计算出IL-1β的浓度。
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照射后24 h收集细胞提取细胞总蛋白，每106个细胞加入100 μl Thermo Scientific Pierce裂解液裂解细胞。蛋白定量方法按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行。取25 μg蛋白进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，采用增强化学发光法检测。以β-肌动蛋白作为内参蛋白。
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用Trizol法提取总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，25 μl体系配制好后，用ABI Prism 7500 Sequence Detection System进行分析。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表 1。
基因名称 引物序列 SIRT1 （正向）5′-GACTTCAGGTCAAGGGAT-3′ （反向）5′-CGTGTCTATGTTCTGGGTA-3′ NLRP3 （正向）5′-ACAGCATTGAAGAGGAGTGGA-3′ （反向）5′-TCGTGTGTAGCGTTTGTTGAG-3′ IL-1β （正向）5′-GTGGCAATGAGGATGACTTGT-3′ （反向）5′-TGTAGTGGTGGTCGGAGATTC-3′ GAPDH （正向）5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′ （反向）5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′ 注：表中，SIRT1：沉默信息调节因子1；NLRP3：Nod样受体蛋白3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 表 1 RT-PCR所用引物序列
Table 1. Sequences of primers used in RT-PCR
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上述实验均重复3次，数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析。组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
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辐射对MSCs IL-1β的影响见图 1。如图 1所示，MSCs在接受照射后，IL-1β胞外分泌量（2 Gy：t=14.47，P＜0.01；4 Gy：t=16.33，P＜0.01）以及胞内表达量较空白对照组明显升高，并且在0~4 Gy照射剂量范围内随着照射剂量的升高而升高，而在8 Gy照射后有所下降。
图 1 不同剂量照射后MSCs IL-1β的分泌和表达水平图中，A：给予MSCs不同剂量（0、2、4和8 Gy）照射，照射后24 h MSCs胞外分泌IL-1β的变化情况（与空白对照组比较，2 Gy：t=14.47，P＜0.01；4 Gy：t=16.33，P＜0.01）；B：MSCs受照后24 h胞内IL-1β蛋白的表达改变。MSCs：间充质干细胞。
Figure 1. MSCs IL-1β expression levels after radiation
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SIRT1 shRNA转染进入细胞后，RNA干扰组SIRT1 mRNA表达水平较白藜芦醇组显著降低（t=15.79，P＜0.01）（图 2中A）。受照细胞给予白藜芦醇后，MSCs IL-1β的分泌水平较单纯照射组显著下降（t=21.68，P＜0.01）。SIRT1基因沉默后，MSCs IL-1β的分泌水平较白藜芦醇组显著升高（t=18.57，P＜0.01），抵抗了白藜芦醇对辐射诱导IL-1β的抑制作用（图 2中B）。给予白藜芦醇后，MSCs的NLRP3和IL-1β蛋白表达水平明显降低，而SIRT1沉默后再给予白藜芦醇，细胞内NLRP3和IL-1β的表达水平较单纯照射组无明显变化（图 2中C）。同样，如图 2中D所示，给予白藜芦醇后，MSCs的NLRP3和IL-1β mRNA水平较单纯照射组明显降低（t=14.44、12.35，P均＜0.01），而SIRT1沉默后，NLRP3和IL-1β的mRNA水平回升至单纯照射组水平（t=14.86、11.12，P均＜0.01），即使再给予白藜芦醇，细胞内NLRP3和IL-1β的mRNA水平仍明显高于白藜芦醇组（t=11.31、10.54，P均＜0.01），提示SIRT1基因沉默后，白藜芦醇对辐射诱导的NLRP3和IL-1β的抑制作用明显减弱。
图 2 SIRT1基因沉默对白藜芦醇抗炎活性的影响图中，A：SIRT1基因沉默后各组SIRT1 mRNA水平；B：SIRT1基因沉默对IL-1β细胞外分泌水平的影响；C：SIRT1基因沉默对NLRP3和IL-1β胞内表达水平的影响；D：SIRT1基因沉默对NLRP3和IL-1β转录水平的影响。SIRT1：沉默信息调节因子1；NLRP3：Nod样受体蛋白3。
Figure 2. Influences on the anti-inflammation effect of resveratrol after SIRT1 gene silence
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众所周知，白藜芦醇是组蛋白去乙酰化酶SIRT1的天然激活剂，具有很好的抗炎症作用[5-7]，近年来有研究发现，白藜芦醇可以通过激活SIRT1蛋白抑制TNF-α引起的炎症反应[8-9]。辐射应激可诱导细胞IL-1β的表达水平升高，进而导致细胞凋亡和组织损伤。本研究发现白藜芦醇具有降低辐射导致的IL-1β的分泌作用，进而减轻由IL-1β产生的炎症反应。提示白藜芦醇可能通过抗炎症反应发挥其辐射防护作用。因此，本研究进一步观察了白藜芦醇是否通过SIRT1通路在IL-1β的上游调控其表达。
受到促炎因素的刺激后，炎症复合体NLRP3可切割proIL-1β使之转化为成熟的炎症因子IL-1β[2]，SIRT1可以通过对炎性相关转录因子进行去乙酰化加工，进而抑制NLRP3的表达[10-11]，所以笔者推测白藜芦醇通过激活SIRT1，降低NLRP3和IL-1β的表达。本研究显示，白藜芦醇可以显著提高SIRT1蛋白在间充质干细胞内的表达水平，说明白藜芦醇很可能是通过SIRT1来抑制辐射诱导IL-1β产生的。然而当细胞内SIRT1基因沉默后，胞内SIRT1 mRNA水平降低，NLRP3和IL-1β水平升高，白藜芦醇的抗炎作用明显减弱，说明SIRT1在辐射诱发而产生IL-1β的过程中具有重要作用，可见白藜芦醇在体外可通过激活SIRT1，抑制NLRP3的表达，进而降低IL-1β的表达，发挥辐射防护作用。
综上所述，白藜芦醇可在体外激活SIRT1，抑制NLRP3的转录和表达，进而抑制炎症因子IL-1β的表达，发挥其辐射防护作用。本研究将为新型辐射防护药物的开发并明确其作用机制提供科学依据。
SIRT1基因沉默在辐射诱导的NLRP3和IL-1β表达中的作用研究
Effects of NLRP3 and IL-1β on radiation-induced expression through SIRT1 gene silencing
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摘要:
目的 研究沉默信息调节因子1（SIRT1）基因沉默对间充质干细胞（MSCs）受照后Nod样受体蛋白3（NLRP3）和IL-1β表达的影响，探讨SIRT1激活剂——白藜芦醇的辐射防护作用及其机理。 方法 将MSCs分为空白对照组、单纯照射组、RNA干扰组、白藜芦醇组和RNA干扰+白藜芦醇组。采用酶联免疫吸附测定、Western blot和RT-PCR等方法检测IL-1β、SIRT1和NLRP3在蛋白和mRNA水平的表达。 结果 辐射可导致MSCs细胞外IL-1β分泌水平明显升高，给予白藜芦醇后，细胞IL-1β分泌水平较单纯照射组显著下降（t=21.68，P＜0.01），NLRP3和IL-1β mRNA水平较单纯照射组明显降低（t=14.44，P＜0.01；t=12.35，P＜0.01），SIRT1基因沉默后，NLRP3和IL-1β的mRNA水平回升至单纯照射组水平（t=14.86，P＜0.01；t=11.12，P＜0.01），即使再给予白藜芦醇，NLRP3和IL-1β的mRNA水平仍明显高于白藜芦醇组（t=11.31，P＜0.01；t=10.54，P＜0.01）。 结论 SIRT1基因沉默减弱了白藜芦醇对辐射诱导的NLRP3和IL-1β的抑制作用，说明白藜芦醇可能通过激活SIRT1、抑制NLRP3、降低IL-1β的表达，从而减轻辐射引起的细胞损伤。 -
关键词:
- 沉默信息调节蛋白质类 /
- 白细胞介素1β /
- 辐射，电离 /
- 白藜芦醇 /
- Nod样受体蛋白3
Abstract:Objective To investigate the effect of silence information regulator-1(SIRT1) on NLRP3 and IL-1β production in mesenchymal stem cells(MSCs) exposed to radiation and to explore the SIRT1 role against radiation. Methods MSCs were divided into control, irradiation, RNAi, resveratrol, and RNAi+resveratrol group. IL-1β, SIRT1, and Nod-like receptor protein 3(NLRP3) expressions were detected using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), Western blot analysis, and real-time PCR assay. Results Extracellular IL-1β secretion induced by radiation was increased significantly. After resveratrol treatment, the levels of IL-1β secretion decreased compared with those of the radiation group(t=21.68, P < 0.01). The mRNA level of NLRP3 and IL-1β also decreased compared with that of the radiation group(t=14.44, P < 0.01; t=12.35, P < 0.01). SIRT1 knockdown significantly suppressed resveratrol-mediated anti-inflammatory activity(t=14.86, P < 0.01; t=11.12, P < 0.01). The mRNA level of NLRP3 and IL-1β remained higher in the RNAi+resveratrol group than those in the resveratrol group (t=11.31, P < 0.01; t=10.54, P < 0.01). Conclusions SIRT1 gene silencing can suppress NLRP3 and IL-1β expression induced by radiation. Thus, resveratrol may alleviate cellular damage induced by radiation through activation of SIRT1, inhibition of NLRP3, and decrease in IL-1β expression. -
图 1 不同剂量照射后MSCs IL-1β的分泌和表达水平图中，A：给予MSCs不同剂量（0、2、4和8 Gy）照射，照射后24 h MSCs胞外分泌IL-1β的变化情况（与空白对照组比较，2 Gy：t=14.47，P＜0.01；4 Gy：t=16.33，P＜0.01）；B：MSCs受照后24 h胞内IL-1β蛋白的表达改变。MSCs：间充质干细胞。
Figure 1. MSCs IL-1β expression levels after radiation
图 2 SIRT1基因沉默对白藜芦醇抗炎活性的影响图中，A：SIRT1基因沉默后各组SIRT1 mRNA水平；B：SIRT1基因沉默对IL-1β细胞外分泌水平的影响；C：SIRT1基因沉默对NLRP3和IL-1β胞内表达水平的影响；D：SIRT1基因沉默对NLRP3和IL-1β转录水平的影响。SIRT1：沉默信息调节因子1；NLRP3：Nod样受体蛋白3。
Figure 2. Influences on the anti-inflammation effect of resveratrol after SIRT1 gene silence
表 1 RT-PCR所用引物序列
Table 1. Sequences of primers used in RT-PCR
基因名称 引物序列 SIRT1 （正向）5′-GACTTCAGGTCAAGGGAT-3′ （反向）5′-CGTGTCTATGTTCTGGGTA-3′ NLRP3 （正向）5′-ACAGCATTGAAGAGGAGTGGA-3′ （反向）5′-TCGTGTGTAGCGTTTGTTGAG-3′ IL-1β （正向）5′-GTGGCAATGAGGATGACTTGT-3′ （反向）5′-TGTAGTGGTGGTCGGAGATTC-3′ GAPDH （正向）5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′ （反向）5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′ 注：表中，SIRT1：沉默信息调节因子1；NLRP3：Nod样受体蛋白3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 
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