经典的非稳定性染色体畸变[如双着丝粒（dicentrics，dic）]、微核（以下所述均为用松胞素B制备的微核，cytokinesis block micronucleus，CBMN）制备技术已经成熟，目前的研究主要涉及这些指标分析的自动化。同时，早熟染色体凝聚（premature chromosome condensation，PCC）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、定向基因组杂交（directional genomic hybridization，DGH）^[4-5]和细胞组学等的发展，使细胞遗传学生物剂量指标更趋完善。

关于受照人员剂量估算最常用的dic和CBMN两项生物剂量计的自动化分析研究，多与生物剂量网络研究合并进行分析。国内关于染色体畸变和微核的自动化分析研究较少，主要原因是具备这两方面知识背景的人员奇缺，而且一般需要细胞遗传学家和图像自动识别专家的合作来完成。

关于dic的自动化分析，世界各国首先建立自己的图像分析软件进行探索性研究，对吉姆萨染色的染色体标本的自动化分析速度、所需最少的细胞数等方面进行探索。如加拿大用原创性分析软件分析dic，结果发现，分析1025个标本时，每例分析200个中期分裂相仅用时1.4 h，大大提高了分析效率^[6]。法国的研究探索了均匀照射和局部照射所需分析的细胞数，考虑到不确定性和分析时间，均匀照射情况下，建议自动化分析至少应分析1000个中期分裂相。最后确定剂量时应根据初始估算剂量确定应分析分裂相数：大于1 Gy时建议为1500个中期分裂相；初始估算剂量低于1 Gy或怀疑局部受照情况，应分析3000个中期分裂相^[7]。随着自动化技术的发展，用荧光染色的中期分裂相更适合自动化分析。Beaton等^[8]用碘化丙啶和着丝粒标记后，用EMD-Millipore公司的ImageStreamX软件在流式细胞仪上进行染色体畸变的分析，结果证实了该方法的可靠性。目前染色体畸变的自动化分析多采用荧光染色的标本。

为了适应快速高通量的分析要求，有研究者提出用人工分析染色体畸变来对受照的大人群进行快速分类的解决办法，一是可以减少每位受照者的分析细胞数，如以dic为观察终点，分析20~50个中期分裂相就可以给出大致分类；二是建立实验室网络以相互支持，发生核与辐射事件情况下可快速分析足够的中期分裂相来快速估算受照剂量。目前dic自动化分析研究集中在自动化分析或半自动化分析与人工分析的比较。De Amicis等^[9]研究认为，分析dic时，每例自动化分析20~500个中期分裂相足够进行分类。在欧盟FP97多种生物剂量（MULTIBIODOSE EU FP97）项目中，组织6个实验室进行半自动化分析和人工分析对比，在半自动化分析中，判定人员分析核对150个分裂相平均用时2 min，而全人工分析50个分裂相需要60 min^[10]。进一步组织8个实验室验证网络云盘照片库的作用^[11]。由其中4个实验室将拍摄的2300个高分辨中期分裂相图片保存在云盘照片库中。这些图片分3种情况：急性照射、局部照射和迁延照射，剂量均为0~5.0 Gy。拍摄照片的4个实验室中，2个实验室采用秋水仙素作用3 h、染色用荧光吉姆萨法，另外2个实验室采用秋水仙素作用24 h、染色用常规吉姆萨染色。参与分析的8个实验室，每个实验室分析3个已知剂量点照射后的中期分裂相（100个细胞/剂量点）用于剂量效应曲线的建立，另外分析3个未知剂量照射后的中期分裂相（50个细胞/剂量点）。开始先用快速浏览模式分析（不仔细确定每条染色体是否存在），然后再进行常规分析（确定46条染色体是否都存在），结果发现，两种方法建立的标准曲线非常类似，线性平方方程的参数无显著性差异。实验室之间、制备和染色方法、秋水仙素作用时间均未影响结果。因此认为，基于网络的dic分析是高通量的生物剂量策略，适于大规模辐射事故情况下的剂量估算。最近的一项研究进一步证明，依靠网络可以最大限度地利用全世界的力量很快获得准确的剂量估算^[12]。模拟一名人员受到⁶⁰Co全身急性照射，该人员未佩戴个人剂量计、2~3 h开始呕吐并出现其他临床症状。来自南美洲、北美洲、欧洲和亚洲的6个实验室参加演练，在不知道受照剂量的情况下，被要求分析超过800个中期分裂相电子图片中的dic，并估算受照剂量，结果发现，估算的平均剂量为1.89 Gy，而实际受照剂量为2 Gy，在允许误差范围内。

未来的dic分析平台包括适于运输的血液采集试剂盒、细胞活性分析仪、自动液体分装仪、中期分裂相自动收获仪、中期分裂相分散仪、高通量标本染色仪和盖片系统、高通量中期分裂相寻找系统、多个卫星重复序列染色体畸变分析系统和计算机控制的标本追踪系统等。

关于辐射诱导的CBMN分析，其优点是经济、容易和快速，不足是本底高而且变异大，与性别和年龄有关，因此大于0.2~0.3 Gy的照射才能被探测到与本底有显著性差别^[13]。最近的发展包括：①由于本底微核的形成多是与落后的整条染色体有关，而照射诱发的微核多是无着丝粒断片，因此，用泛着丝粒探针的FISH技术很容易分辨微核是来自本底还是照射诱导^[14]；②分析双核细胞中的核质桥提高辐射特异性；③大样本的快速自动化分析。不同实验室使用的CBMN自动化分析软件有所不同，如MetaSystems Metafer MNScore（image cytometry）systems、ImageStreamX和Fast image analysis等^[15-17]。在Lyulko等^[17]的研究中，采集7个人的指尖血，0~10 Gy离体照射，用不同的荧光染色细胞质和细胞核，用Fast image analysis软件（美国快速自动化生物剂量工具Fast automated Biodosimetry Tool的一部分）分析单核细胞与双核细胞之比，结果发现这些指标均随剂量增加而增高。自动化分析结果与手动分析结果的相关系数达到0.914~0.998。对CBMN的人工和自动化分析比较显示，自动化分析100~200个双核细胞足以进行临床的快速分类^{[9, 18]}。

有研究者提出，适用于dic和CBMN快速高通量自动化分析的未来平台应包括用于自动化分析的、放置在架子上的微平板和微试管。快速高通量分析平台开始于用排列在标准化架子上的微试管取血，结束于在标准化多孔和多通道平板中进行的细胞遗传学分析^[19]。

以胞质分裂阻滞法为基础建立的细胞组学分析，除了可以分析微核外，还可以分析核质桥、核芽、细胞坏死与细胞凋亡、核分裂指数等指标。其中核质桥是近年来研究最多的指标之一^[21]。其原因有：①核质桥形成机制之一认为核质桥来源于dic，因为dic是辐射特异的生物标志物，因而核质桥有可能达到生物剂量计辐射特异的要求；②胞质分裂阻滞方法获得的标本可以避免常规染色体畸变分析因间期细胞死亡而造成可供分析细胞数偏少的问题；③容易实现自动化分析。这些原因使得核质桥分析结合了dic和CBMN的优点，因此最先建立CBMN方法的澳大利亚Fenech教授提出，核质桥有潜力成为辐射生物剂量计^[21]。

笔者所在的实验室对电离辐射诱发的人外周血淋巴细胞核质桥进行了分析，研究发现核质桥不仅在较高剂量范围（⁶⁰Co γ射线，0~6 Gy）内可以有良好的剂量效应关系^[22]，而且在0~1 Gy、0~0.4 Gy剂量范围内均有良好的剂量效应关系，只是在低剂量范围内分析细胞数要相应地增加（未发表的资料）。进一步的研究显示：高传能线密度射线¹²C⁶⁺诱导的人外周血淋巴细胞核质桥发生率在0~8 Gy范围内具有良好的剂量效应关系。最新的研究表明，核质桥是来源于dic染色体，用泛着丝粒探针的FISH显示核质桥上有两个着丝粒信号^[23]。接下来的研究将对电离辐射诱导人外周血淋巴细胞核质桥的影响因素进行分析。

PCC主要适用于受到大剂量照射人员的剂量估算。目前有关PCC的研究，一方面是PCC制备方法的发展和完善，另一方面是探索哪些指标可以用于剂量的估算。有少量研究已开始关注该方法用于局部受照剂量估算的可行性。

关于PCC制备方法，最近主要是围绕用化学试剂诱导产生的方法，这些化学物质主要是花萼海绵诱癌素A（Calyculin A）和冈田酸（okadaic acid）。早期是细胞培养开始后46 h加入这些化学物质，作用2 h后收获。最近的研究表明，1~10 Gy照射的外周血样本培养40 h或42 h所得到的PCC环（PCC-R）的结果与培养48 h的结果差异无统计学意义^[24]。为了更快地获得PCC标本，有研究用花萼海绵诱癌素A、ATP、p34（cdc2）/cyclin B激酶作用6~12 h，就可以大量得到各个细胞周期的PCC。在此基础上，最近的研究用间期细胞，不用有丝分裂刺激剂使细胞进入细胞周期，加入ATP、p34（cdc2）/cyclin B激酶，培养3~6 h，就可以获得PCC标本，用FISH方法来判定染色体畸变，大大提高了分析的可靠性^[25]。

关于用于剂量估算的PCC指标，研究最多、应用最广的是PCC-R，在日本东海事故和中国太原事故^[26]中得到实际的应用。除了最常用的PCC-R，还有探索细胞中染色体和染色体片段总数目、最长与最短染色体长度比、最长染色体长宽比以及PCC指数等指标来进行剂量-效应的研究^{[24, 27-28]}。最近的研究利用离体照射的外周血PCC标本，分析0~10 Gy电离辐射后细胞周期进展系数（cell cycle progression index，CPI），CPI为G2/M-PCC与G1-PCC之比，结果发现，CPI与照射剂量之间为指数关系，CPI不受性别和个人差异的影响。因为分析1例CPI的时间少于15 min，因此作者认为CPI分析可在事故早期获得受照人员生物剂量的结果^[29]。

FISH技术分析染色体易位主要用于回顾性剂量重建。用FISH分析染色体易位的方法基本完善，目前的研究主要用于回顾性剂量估算的可行性，包括是否需要扣除易位本底发生率、受照后多长时间估算剂量不会显著降低（即染色体易位率稳定的时段）、低估的剂量能否通过转换系数提高估算的准确率等方面。我们的研究中用已知事故当时有dic估算的生物剂量资料的受照人员，在不同时间后用FISH技术进行回顾性剂量重建，比较两种估算剂量的差别，结果发现，在受照后10年内用FISH回顾性重建的剂量与事故当时的生物剂量无显著性差别，超过10年的回顾性重建的剂量显著低于事故当时的生物剂量。儿童期受照易位率下降的速度更快^[30]。

分子生物学水平的生物剂量学新指标的研究主要围绕电离辐射所致的DNA损伤、基因表达水平（RNA）和蛋白质水平改变。这些指标的优势是可以实现快速、高通量分析；不足是辐射特异性差、个体差异大和影响因素多，因此目前还没有可以替代dic和CBMN分析的指标。

辐射诱导的DNA双链断裂水平可以用单细胞凝胶电泳和磷酸化H₂AX（phosphorylated histone H₂AX，γ-H₂AX）分析方法来测定。单细胞凝胶电泳，也称彗星分析，从单细胞水平分析DNA链断裂的程度。有研究证实尾长和尾距均与照射剂量成正比^[31]。但是，该方法适用的时间范围需要进一步研究，因为DNA修复系统很快使DNA双链断裂水平迅速降低。目前研究最多的是辐射诱导的γ-H₂AX水平分析。

真核细胞中的DNA不是游离存在的，而是与组蛋白和非组蛋白形成复合物。生物体接受电离辐射照射时，H₂AX基因编码的组蛋白在DNA双链断裂处产生的γ-H₂AX对DNA的这种损伤能够做出快速敏感的反应。细胞在电离辐射作用后，几分钟内H₂AX即可迅速发生磷酸化并在DNA双链断裂位点簇集形成焦点。对γ-H₂AX水平的分析，目前主要有两种方法：一是免疫荧光方法分析γ-H₂AX焦点，二是用流式细胞仪分析γ-H₂AX蛋白水平。最近的研究不仅分析γ-H₂AX焦点，还同时分析p53结合蛋白1（p53 binding protein 1，53BP1）等其他DNA双链断裂焦点^[32]。Lamkowski等^[33]用49 Gy局部照射哥廷根迷你猪腰部后4、24和168 h分析外周血DNA损伤焦点（γ-H₂AX、53BP1和有丝分裂重组蛋白11）的形成，结果表明，如果细胞内焦点发生大片融合或者细胞内焦点数目多而使其偏离泊松分布，可能提示受到急性大剂量局部照射。

照射剂量与γ-H₂AX水平之间的剂量-效应关系不仅在离体照射的人外周血淋巴细胞中得到证实，而且在大鼠和灵长类动物中均可观察到。不仅低传能线密度射线诱导的γ-H₂AX水平具有良好的剂量效应关系，中子等高传能线密度射线也可建立R²较高的剂量效应曲线。最近有研究比较了中子照射和⁶⁰Co γ射线诱导γ-H₂AX的特点，结果发现中子诱导的γ-H₂AX绝对水平低于γ射线，但前者稳定存在的时间长^[34]。有研究用淋巴细胞亚群特异的细胞表面标志物结合多色流式分析γ-H₂AX水平，提示这种方法可以更准确地反映淋巴细胞某些亚群的辐射敏感性^[35]。国内Wang等^[36]的研究中利用流式细胞仪分析淋巴细胞和粒细胞中的γ-H₂AX水平，发现粒细胞中的γ-H₂AX水平在各剂量点变化不大，可作为内参；而且淋巴细胞中γ-H₂AX水平经内参调整，使个体差异性降低，有利于剂量估算准确率的提高。

最近的两项研究着重探索大规模核与辐射事故情况下快速分析γ-H₂AX水平来估算剂量的可行性，研究发现可以用少量血（0.1 ml）、甚至是指尖血来进行高通量、自动化γ-H₂AX水平分析，大大提高了分析和估算剂量的速度^{[32, 37]}。

在欧盟已经组织了γ-H₂AX焦点生物剂量技术比对，有8个实验室参与^[38]。比对的内容分为两部分：一部分来自8个受照样品的200个图片的焦点分析，另一部分是在照后4~24 h内获得10个新鲜血液样品，进行γ-H₂AX焦点分析，并估算剂量，结果发现，虽然各实验室建立的剂量效应曲线差异比较大，但是剂量估算的结果差异不很显著。作者认为两种方式均可以快速鉴别大剂量受照者，以便进行更为准确的生物剂量估算。

关于基因表达作为辐射生物剂量计的研究，目前主要集中在辐射敏感基因组合的组成、如何降低个体及分析的变动性、全身受照人员的验证等方面。

有研究认为，3~20个基因组合可以用来有效地估算受照剂量^[39]。Chauhan等^[40]用0~1.5 Gy的α粒子照射外周血24 h后，测定其基因表达水平的改变，发现各剂量均发生改变的基因有29个。与X射线相比，α粒子并没有诱导出不同的基因发生表达改变，只是发生基因表达改变的倍数不同而已。Tucker等^[41]用0~10 Gy的⁶⁰Co γ射线照射60例成年供血者，0.5、1和2 d后用实时荧光定量PCR分析经过筛选的121个基因的表达变化，结果发现，3~4个基因（其中包括星触蛋白2、细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂1A、生长分化因子15和共济失调性毛细血管扩张突变基因）的表达变化在各时间点均非常明显。在0~6 Gy范围内实际照射剂量与预期剂量非常一致，超过8 Gy就达到饱和。但我们的研究发现，在0~10 Gy照射剂量范围内，P53可诱导基因3表达水平在72 h内与剂量成直线关系^[42]。

由于个体之间放射敏感性和机体状态的差异，使得用基因表达来估算剂量的准确率大大降低，Forrester等^[43]的研究结果认为，选择顺式相关内参基因可以提高估算剂量的准确率。Lucas等^[44]介绍了一种探索基因表达水平辐射生物剂量学指标的新途径，首先整体照射小鼠等动物模型，在此基础上再进行人外周血离体照射和全身照射治疗患者的基因表达改变分析。作者认为后两者的结合（离体照射和全身照射患者的分析）可以很准确地预测人员照后状态。虽然全身受照患者的样本比较小，但是区分患者剂量水平的准确性不受性别、诊断或前期化疗的影响。将这些辐射敏感基因引入快速高通量的化学连接依赖探针扩增分析（chemical ligation-dependent probe amplification assay，CLPA），该方法可以获得离体照射和整体照射的外周血样品的准确受照剂量。因此作者认为CLPA可以作为生物剂量分析的候选方法。

辐射诱导细胞内蛋白质水平改变的研究主要集中在蛋白质组学筛选，用双向蛋白质电泳或质谱扫描分析筛选获得的辐射敏感蛋白质。在此基础上进行详细定量研究。目前的研究均有各自的发现，但是能够在多个研究中可重复存在的与辐射相关的蛋白质种类很少。目前的研究仍集中在小鼠、大鼠和灵长类模型的分析。

最近的研究用受到不同剂量照射后的小鼠筛选出多种辐射敏感蛋白质，其中有8个人类蛋白质的类似物。Deperas-Kaminska等^[45]对8个特定蛋白质进行研究，观察16例进行射线束外照射放疗的乳腺癌患者在照射2、10和20 Gy当天或者46~50 Gy后一个月（均是每天照射2 Gy，分别照射1、5、10和23~25次）蛋白质水平变化情况，结果发现，血清阿普脂蛋白E（Apolipoprotein E）和泛酸酯激酶4（pantothenate kinase 4）水平可以用来区分患者受到的照射剂量是大于2 Gy还是小于2 Gy、大于10 Gy还是小于10 Gy。

用于辐射生物剂量计筛选的代谢组学主要集中在对小鼠、大鼠和灵长类的研究，所用样品为尿液，一般采用高效液相色谱和质谱技术相结合分析尿中的代谢物水平，研究结果显示，有一些代谢物的改变在辐照后的各种实验动物中共同存在。

Sharma等^[46]利用已经建立的大鼠模型进行研究，全身照射或肾脏局部照射10 Gy X射线后24 h，用液相色谱-质谱联合仪或质谱分析尿蛋白组份改变，结果发现，照射后尿蛋白/肌酐比值、尿白蛋白降低，全身照射比局部照射降低程度更大。急性期或急性肾损伤时，尿液中半胱氨酸超家族蛋白和α-1-酸性糖蛋白增多；在蛋白酶和蛋白酶抑制剂中，血管舒缓素相关肽酶b24、糜蛋白酶类似活性前体和产物水平增高；氧化组胺升高。因此，作者认为，照射后早期进行尿蛋白质组学分析可以提供辐射生物剂量学指标。有研究鉴定灵长类的尿代谢标志物是否与啮齿类相同。每组6个类人猿，照射不同剂量的⁶⁰Co γ射线（0、1.0、3.5、6.5和8.5 Gy），经高压液相色谱和飞行时间质谱分析，得到13个由辐射诱导的标志物，其中增高的是乙酰牛磺酸和羟基乙磺酸、降低的是黄嘌呤和次黄嘌呤，和前期鼠类研究结果一致^[47]。

最近，有学者首次用辐射代谢组学方法分析照射前后人尿液中代谢物的变化。选取全身照射的患者，单次照射1.25 Gy后4~6 h、或3.75 Gy分3次照射（1.25 Gy/次）后24 h收集尿液进行高压液相色谱和飞行时间质谱分析，结果发现，照射前后有7个标志物水平发生变化，其中4个与脂肪酸跨线粒体转运进行β氧化有关，包括3-甲基赖氨酸、肉毒碱共轭的乙酰肉毒碱、癸酰基肉毒碱、辛酰基肉毒碱；另外3个是嘌呤代谢终产物，包括次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸。该研究还发现这些代谢变化在性别间是不同的^[48]。

血清中微量元素水平变化作为辐射生物剂量计的最新研究主要集中在国内南京航空航天大学张海黔的实验室。对小鼠模型全身照射后，测定小鼠外周血（眼眶静脉血）中铜、锌和铁的水平变化^[49-51]，结果发现，血清铜在1~7 Gy照射剂量范围内随着剂量的增加而降低，其降低可以持续28 d；血清锌在照射1、2、4和8 Gy后水平也是随着剂量的增加而降低，可持续21 d；而血清铁在0.5~7 Gy范围内与照射剂量成正比。此研究显示血清中铜、锌和铁水平有望成为快速生物剂量计。但是这些研究结果有待其他实验室的验证。

EPR用于剂量估算的研究原来主要集中在牙釉、骨等的测定，结果非常准确、可重复测量，但是测定均为破坏性，而且牙齿在体测定的误差较大。最近的研究除了完善牙釉和骨的前处理和测定方法外，主要集中在对人的指甲或趾甲、头发的EPR测定上。

Trompier等^[52]的研究分成两批试验：一是用15名供者的90个指甲样品，进行样品制备和无本底信号影响的信号谱分析，结果表明，实际辐射诱导信号和信号谱分析获得的辐射诱导信号是一致的；信号强度与照射剂量（0~6 Gy）之间为直线关系。二是用16名供者的96个指甲样品来验证信号谱拟合模型，此时考虑了本底信号。同样表明信号强度与照射剂量之间为直线关系。虽然发现个体差异对估算剂量的影响，但是该研究提示用人指甲估算剂量的可行性。He等^[53]研究证实，手指甲或脚趾甲角蛋白基质中辐射诱导信号是稳定的。研究认为用EPR方法测定指甲中的自由基信号来估算剂量，其优点是指甲或趾甲是普遍存在的、容易获得、无侵害性、有潜力实现快速剂量估算；缺点是样品制备过程中机械来源的信号和辐射诱导信号的交叉，并且有很多因素（指甲组成、温度、湿度、水份和氧水平）会影响信号谱的测定和剂量估算。

对人头发进行EPR测定的研究很少。Tepe Cam等^[54]收集女性头发样品，按照头发的颜色、供者年龄、自然或染色分类，将自然黑、红、金色头发和染成黑色的头发进行照射，结果发现，EPR信号谱的峰高和g值是依赖颜色的，黑色头发样品之间的谱构成和信号强度变异小。不同颜色头发的EPR信号强度在室温下降低一半的时间不同，红色头发降得最快，黑色头发最慢。该结果提示用黑色头发进行ESR测定信号强度变异小且稳定。

由于随时存在着恐怖袭击事件发生的可能性，发生后情况非常复杂，可能有大人群受到意外照射，这就需要对人群快速分类，需要快速高通量的生物剂量计^[55]。因此快速高通量的辐射生物剂量计的建立和应用依然是目前研究的重点。世界卫生组织在2007年12月启动了国际生物剂量网络（BioDoseNet），意在组织全世界的生物剂量力量应对大规模事故的处置。欧盟也建立了由16个国家的23个实验室组成的欧洲生物剂量网络（RENEB）。主要是运行平台建设、比对演练、技术培训、质量保证、新技术和新合作者的寻找等^[56]。各大洲也相继建立各自的生物剂量网络，我国同样需要建立生物剂量网络，尽快提高网络实验室的实力，真正能够在发生大规模核与辐射事故情况下快速给出生物剂量估算。

在目前所有的生物剂量计中，dic和微核分析依然是应用最广泛和最可靠的指标^[57]，目前的研究重点是自动化分析技术的成熟和完善。由于目前的分子生物学相关指标可以实现高通量分析，虽然不能达到辐射特异性的要求，对其影响因素系统研究，但能够定量其他因素的影响程度，也会提供有用的生物剂量信息。因此，多个生物剂量学指标联合分析是未来的方向。