吲唑-3-羧酸购自常州瑞明药业；L-酪氨酸乙酯盐酸盐购自上海翰宏化工有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基-苯并-三氮唑购自上海共价化学科技有限公司；其他试剂均为市售分析纯，不经纯化直接使用。昆明种小鼠，雌雄各半，鼠龄6~8周，体质量18~22 g，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。可移植性实验肿瘤H₂₂肝癌瘤株由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。PBS、培养基和胎牛血清等购自Hyclone公司。¹³⁷Cs射线（Gammacell40，加拿大Nordion International Inc.）照射源，剂量率为0.8077 Gy/min。

N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠由起始原料吲唑-3-羧酸经混酸消化后与酪氨酸的酯缩合而成。合成路线如图 1所示。

图  1  N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠的合成路线  图中，EDC·HCL：1-（3-二甲氨基丙基）-3-2基碳二亚胺盐酸盐。

Figure 1.  Synthetic route of N-(5-nitroindazole-3-formyl)tyrosine sodium

100 ml三口瓶装机械搅拌，加入21 ml发烟硝酸，冰盐浴冷却，滴入20 ml浓硫酸（95%~98%）。滴毕，分次加入吲唑-3-羧酸6.7 g（0.05 mol）。整个过程控制温度不超过0℃。加毕，室温下搅拌3 h后将反应液倾入200 g碎冰中，抽滤收集固体，干燥，用95%乙醇重结晶，得白色粉末状固体（5-硝基吲唑-3-羧酸），抽滤收集得6.5 g。收率74%。熔点259℃~260℃。

圆底瓶中加入1.1 g（5 mmol）5-硝基吲唑-3-羧酸、1.3 g（6 mmol）酪氨酸乙酯盐酸盐、1.2 g（6 mmol）1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.8 g（6 mmol）1-羟基-苯并-三氮唑和50 ml二氯甲烷，搅拌下滴入0.9 ml（6 mmol）三乙胺。室温下搅拌5 h，过滤，滤液依次用蒸馏水（20 ml×1）、2%盐酸（20 ml×3）、0.25%氢氧化钠水溶液（20 ml×3）、蒸馏水（20 ml×3）洗，用无水硫酸钠干燥，蒸干，加入10%氢氧化钠水溶液10 ml，室温下搅拌1 h，用5%盐酸调pH=3，析出白色固体N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸，抽滤收集，水洗，所得固体溶于3 ml 10%氢氧化钠水溶液中，向溶液中加入无水乙醇，抽滤收集固体，干燥。得土黄色粉末0.82 g，即为终产物。收率42%。熔点230℃~231℃。

所得产品经核磁共振氢谱和红外光谱进行鉴定，并经高效液相色谱法测定含量。

将H₂₂肿瘤细胞悬液（浓度为1×10⁷个/ml）注射于小鼠右后脚背侧皮下，每只小鼠0.1 ml。瘤体体积达到约150 mm³时随机分组进行实验。将移植瘤小鼠随机分成4个大组，8个亚组，每个亚组8只。分别为：乏氧空白对照组（采用外科动脉夹，夹住小鼠荷瘤肢体的根部，阻断小鼠荷瘤肢体血流10 min）、乏氧给药组[分为高、中、低3个亚剂量组（200、125、50 mg/kg）腹腔内单次注射给药]、乏氧照射组（6 Gy单次照射）、乏氧照射+给药组（高、中、低3个亚剂量组，给药后1 h乏氧条件下6 Gy单次照射）。照射后尽快恢复血液供应。治疗开始后，用游标卡尺每隔1 d测量肿瘤的3个直径a、b、c。按公式V=a×b×c×π/6计算肿瘤体积。计算肿瘤体积相对于初始体积的倍数，绘制肿瘤体积增长倍数对时间的曲线，计算肿瘤体积增至约实验开始时体积的3倍所需时间与乏氧空白对照组所需时间的差值（TGD）。药物加照射组的肿瘤生长延迟时间与单纯照射组的肿瘤生长延迟时间之比作为放射增敏比（SER），SER=TGD_增敏治疗/TGD_单照射。

5 mg N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠溶解在25 μl PBS后，经4192×g离心10 min取上清液得饱和溶液。取100 μl加入1.5 ml具塞玻璃标记管中，加入4 μl（14.8 MBq）Na¹²⁵I混合，再加入0.8 mg氯胺T（1 mg/100 μl PBS），室温振荡5 min，加入30 μl偏亚硫酸钠溶液（1 mg/100 μl PBS）终止反应。反应混合物转移到1×12 cm Sephadex G-75层析柱上进行分离。用PBS洗脱，每管收集5滴，连续收集70管。测量各管的放射性强度，收集第32~42管合并，约1.5 ml，即为标记化合物¹²⁵I-N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠。

肿瘤动物模型12只，每只按0.1 ml/10 g动物体质量给药。给药后不同时间（0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h）分批处死动物，取血液和各脏器（称重），测定放射性强度。计算每克组织百分注射剂量率（%ID/g）。

N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠的总收率为31%。由其红外图谱可知该化合物具有硝基、酰胺基等特征基团。将N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸做成钠盐与其酸的氢谱对比判断得出，除羧基氢外其他各氢仍在，结合红外与核磁共振测试结果可知该化合物结构为N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠。

以水:甲醇（40:60）为流动相，1 ml/min，十八烷基硅烷柱（waters公司）进行含量测定，N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠出峰时间为2.5 min，含量为97.5%。可以满足后续实验要求。

根据各组小鼠肿瘤平均体积，绘制肿瘤生长倍数对时间曲线。N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠的高、中、低剂量组乏氧状态下的肿瘤生长倍数曲线与乏氧空白对照组肿瘤生长倍数曲线见图 2A，乏氧状态下，各治疗组与乏氧照射组的生长倍数曲线见图 2B。

图  2  单给药及联合照射治疗对小鼠肿瘤生长的影响

Figure 2.  Effects of drug treatment and drug combined with radiotherapy on tumor xenograft growth in mice

由图 2A可见单给药各组肿瘤增长倍数曲线与乏氧空白对照组趋势相同，表明单给药各剂量组对肿瘤生长基本无作用。图 2B可见各剂量组联合照射后肿瘤增长速度低于空白对照组，其中单照射与高、中、低剂量联合照射组的TGD分别为6 d、9 d、10 d、8 d。高、中、低3个亚剂量组的SER值分别为1.50、1.67、1.33，平均为1.50，表明该药对小鼠H₂₂肿瘤模型具有一定的放射增敏作用。

N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠与Na ¹²⁵I的反应混合物经Sephadex G-75层析柱进行分离，收集¹²⁵I-N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠峰，所得产物的放射性活度为5.92 MBq。

由图 3可见，N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠在肿瘤部位的分布高于脑和肌肉组织，该化合物肿瘤与脑和肌肉的分布比皆大于5。正常脏器（肝、脾、肺）中较高的放射性计数可能源于标记化合物的体内脱碘。肾脏的放射性活度高表明该化合物主要经泌尿系统代谢。

图  3  ¹²⁵I -N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠在荷瘤小鼠体内分布

Figure 3.  Biodistribution of ¹²⁵I -N-(5-nitroindazole-3-formyl)tyrosine sodium in mice bearing neoplasm

硝基吲唑类化合物属亲电子类乏氧增敏剂，具有较好的放射增敏活性，但由于该类化合物脂溶性大，在神经系统分布较高且具有较大的神经毒性，限制了其在体内的应用。本实验通过在硝基吲唑母核上引入酪氨酸并成盐降低了其脂溶性，并通过荷瘤小鼠模型考察了其乏氧增敏活性和体内分布特性。通过缩合剂法合成的N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠经红外与核磁共振确定了结构。缩合剂法条件温和，后处理简单，合成效率较高，经重结晶后所得目标化合物具有较高的纯度，可以满足生物实验的需要。

肿瘤体积增大到一定程度后其内部会形成乏氧区，乏氧肿瘤细胞对放化疗具有较强的抗性，是临床放化疗失败和肿瘤复发的原因之一。本实验用荷瘤H₂₂小鼠模型考察了N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠的乏氧增敏活性，在治疗前阻断荷瘤部位血流模拟临床乏氧条件，单给药组（高、中、低3个亚剂量组）的肿瘤增长曲线与乏氧空白对照组类似，肿瘤增长速度与乏氧空白对照组相似，表明该化合物对肿瘤基本无作用。合并放疗后各给药组的肿瘤增长速度较单照射组相对减缓，3个亚剂量组肿瘤增长到初始体积3倍的生长延缓时间均低于单照射组，其平均SER为1.5，表明该化合物具有一定的乏氧增敏活性。

N-（5-硝基吲唑-3甲酰）酷氨酸钠含有酪氨酸残基，可以标记¹²⁵I进行体内分布研究。本实验通过氯胺T法进行了放射性碘标记，Sephadex G-75柱层析得到了¹²⁵I -N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠，荷瘤小鼠注射标记化合物后考察了该化合物不同时间点的体内分布情况，结果表明该化合物主要经泌尿系统代谢，肿瘤组织在0.5~1 h时有较高的放射性摄取，肌肉和神经组织的分布小于肿瘤组织。

以上结果可知N-（5-硝基吲唑-3-甲酰）酪氨酸钠易于合成和纯化；其本身对肿瘤组织无作用，合并放疗后对肿瘤组织具有一定的乏氧增敏活性，并且在肿瘤组织中具有较高的摄取，表明该化合物作为乏氧增敏剂值得进一步研究。