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造血免疫系统是电离辐射最敏感的组织之一，是急性辐射损伤防治研究的重点。国际原子能机构在2004年修订版的《辐射损伤的诊断和治疗》中指出，当估计吸收剂量＞2 Gy时，应尽早使用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及促红细胞生成素[1-2]。但动物实验表明，单纯应用重组人G-CSF仅能促进辐射损伤后粒系造血功能的恢复，并可损伤造血干细胞功能，G-CSF联合其他因子或化合物可能取得更佳的治疗效果[3-4]。
前期利用p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）抑制剂SB203580（以下简称SB），发现SB可减少辐射诱导的小鼠免疫细胞损伤，进一步联合G-CSF还能有效缓解4 Gy和6 Gy照射引起的造血系统损伤[5~6]。本研究在小鼠接受4 Gy全身照射后，腹腔注射G-CSF和SB，检测联合用药对小鼠接受4 Gy全身照射后免疫系统损伤的影响。
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SB（LB lab，美国）；G-CSF（杭州九源，中国）；RPMI1640培养基、小牛血清（Gibco，美国）；活性氧染色试剂（碧云天，中国）；细胞计数仪（尼康，日本）；多功能酶标仪（Tecan，瑞士）；流式细胞仪（Beckman，美国）；137Cs γ射线照射源（Autocell40，加拿大）。
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C57BL/6雄性小鼠，8~10周龄，20~24 g/只，共30只，购自北京维通利华实验技术有限公司。
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将C57BL/6小鼠按体质量随机分为对照组、照射组和给药组，每组10只。对照组接受假照射，照射组和给药组小鼠给予4 Gy 137Cs γ射线全身照射。给药组小鼠腹腔注射G-CSF（1 μg/只），照射后2 h和6 h给药，连续给药5 d；同时于照射后24 h腹腔注射SB（15 mg/kg），随后隔日给药，共给药5次。
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在照射后第10天，摘除眼球取血，用乙二胺四乙酸三钾溶液抗凝，用细胞计数仪计数。
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取50 μl外周血加入到1 ml红细胞裂解液中，轻微震荡混匀后室温放置15 min。用PBS离心洗涤2次后弃上清，用100 μl PBS悬起细胞沉淀。无菌取小鼠胸腺，用磨砂玻片挤压过滤，调整细胞浓度为5×105~1×107/ml。取100 μl胸腺细胞悬液。向获得的白细胞或者胸腺细胞悬液中加入相应抗体混匀，避光孵育15 min，随后加入400 μl PBS，分别转入流式管，用流式细胞仪检测。
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取小鼠胫腓骨，研磨过滤后计细胞数，调整细胞浓度为5×105~1×107/ml。取100 μl细胞加入至稀释好的红色荧光染色试剂中，37 ℃下孵育30 min后，使用1640溶液洗涤2次，将细胞转入黑色96孔板中，使用酶标仪进行检测。
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所有实验结果均以（x±s）表示，数据分析采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
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在照射后第10天，取外周血进行分析。与对照组相比，照射组小鼠白细胞数、红细胞数、血红蛋白、红细胞比容、血小板数均显著下降（t=15.45、7.563、6.753、7.032、6.994，P均＜0.05），给药组除血小板外均显著下降（t=12.15、6.305、5.060、5.727，P均＜0.05）。与照射组相比，给药组红细胞、红细胞比容以及血小板计数显著升高（t=4.031、3.065、5.138，P均＜0.05）。以上结果表明联合给药对小鼠红细胞和血小板有保护作用（表 1）。
组别 白细胞数
（109/L）红细胞数
（1012/L）血红蛋白
（g/L）红细胞比容（g/L） 血小板数
（109/L）对照组 6.6±1.2 10.4±0.5 15.5±0.9 0.52±0.03 714±84 照射组 2.1±0.6 9.1±0.4 13.6±0.5 0.46±0.02 301±93 给药组 2.5±0.2 9.5±0.2 14.0±0.4 0.49±0.01 627±161 表 1 粒细胞集落刺激因子联合SB203580给药对4 Gy照射小鼠外周血计数的影响
Table 1. The effects of SB203580 and granulocyte colony-stimulating factor on the peripheral blood of mice received 4 Gy total body irradiation
(x±s) -
在照射后第10天，取外周血白细胞进行检测。与对照组比较，照射组（t=9.479、4.673，P均＜0.05）和给药组（t=12.92、13.97，P均＜0.05）CD8和B220细胞比例下降，给药组CD4细胞显著上升（t=10.06，P＜0.05）。与照射组相比，给药组CD4和CD8细胞比例显著升高（t=11.18、5.622，P均＜0.05）。以上结果表明联合给药能有效保护外周血CD4和CD8细胞（表 2）。
组别 CD4 CD8 B220 对照组 22.1±3.6 21.3±2.2 41.8±9.8 照射组 21.6±5.2 8.6±2.8 9.3±4.4 给药组 35.9±2.3 14.8±3.2 6.1±1.1 表 2 小鼠外周血白细胞分型
[(x±s)%] Table 2. The peripheral white blood lymphocyte pheno- types in different mice groups
[(x±s)%] -
在照射后第10天，取胸腺细胞检测。与对照组比较，照射组和给药组小鼠胸腺细胞双阳性细胞（CD4+CD8+）比例增加（t=17.21、11.58，P＜0.05），CD4+CD8-细胞比例下降（t=6.407、10.46，P＜0.05）。而与照射组相比，给药组小鼠胸腺细胞双阳性细胞比例下降（t=5.631，P＜0.05），双阴性细胞比例上升（t=5.874，P＜0.05）（表 3）。
组别 CD4-CD8- CD4+CD8- CD4-CD8+ CD4+CD8+ 对照组 50.9±3.2 18.2±3.5 8.6±1.6 22.3±4.0 照射组 35.7±1.7 10.9±1.6 5.2±0.9 48.2±1.8 给药组 51.0±3.2 6.2±0.9 3.1±1.0 39.7±2.8 表 3 小鼠胸腺细胞分型
[(x±s)%] Table 3. The thymocyte phenotypes in different mice groups
[(x±s)%] -
在照射后第10天，检测小鼠骨髓细胞活性氧水平。与对照组相比，照射组和给药组小鼠的骨髓细胞活性氧水平显著升高（t=13.61、10.77，P＜0.05）。与照射组相比，给药组骨髓细胞活性氧水平有所下降，差异无统计学意义（表 4）。
组别 活性氧（荧光值） 比例（%） 对照组 4252±184 100±4.3 照射组 5767±195 136±4.6 给药组 5444±423 128±10 表 4 小鼠骨髓细胞活性氧水平
Table 4. The reactive oxygen species level in mice bone marrow cells
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造血及免疫系统损伤是急性放射病致死的主要原因之一。G-CSF是临床上广泛应用的一种常用造血细胞因子。前期研究发现G-CSF联合SB比其单用更能有效缓解辐射造成的细胞数量和功能下降[5-6]。
机体受到辐射后，造血免疫系统受到损伤，引起外周血象的变化[7]。本研究通过观察小鼠外周血计数，分析联合给药对小鼠免疫功能的影响，实验结果提示在4 Gy 137Cs γ射线全身照射后，外周血白细胞总数及其他指标均显著下降。而联合给药后红细胞数及血小板数显著升高，提示联合给药对辐射造成的红细胞和血小板损伤有保护作用。而辐射后免疫系统恢复是减少辐射致死的重要因素。本研究利用流式细胞仪对外周血白细胞进行分型测定，发现联合给药可减少辐射造成的CD8杀伤细胞下降的比例，表明联合给药能促进免疫系统恢复。进一步分析胸腺细胞分型，发现联合给药可显著提高受照后CD4-CD8-细胞比例，这与赵红霞等[8]的研究结果相似。
本研究结果提示在急性辐射损伤救治时采用G-CSF联合p38 MAPK抑制剂可减少外周血红细胞及血小板的降低，促进外周血CD8和CD4细胞的恢复，增加胸腺细胞双阴性小鼠的比例，有助于小鼠免疫系统的恢复。但是其联合作用机制仍有待进一步阐明。本研究结果为临床急性辐射损伤治疗提供了新的思路。
G-CSF联合SB203580对4 Gy照射小鼠免疫系统的作用
The effects of G-CSF combined with SB203580 on the immune system of mice received 4 Gy total body irradiation
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摘要:
目的 研究G-CSF联合p38抑制剂SB203580（SB）对免疫细胞辐射损伤的作用。 方法 C57BL/6雄性小鼠按体质量随机分为对照组、照射组和给药组。照射组和给药组给予4 Gy全身照射。给药组小鼠给予腹腔注射G-CSF和SB，G-CSF于4 Gy照射后2 h和6 h给药（1 μg/只），每天2次，连续给药5 d，SB于照射后24 h给药（15 mg/kg），隔日给药，共给药5次。照射后10 d测外周血计数，进行白细胞CD4、CD8、B220检测、胸腺细胞CD4、CD8检测和骨髓细胞活性氧检测。 结果 照射组外周血计数和CD8、B220比例下降，而胸腺细胞中CD4+CD8+细胞比例及骨髓细胞活性氧水平显著增加。与照射组相比，联合给药组外周血红细胞数、血小板、CD4、CD8细胞比例升高，胸腺细胞中CD4+CD8+细胞比例下降。 结论 G-CSF联合SB对4 Gy照射引起的免疫细胞损伤存在保护作用。 Abstract:Objective To observe the effects of G-CSF combined with SB203580(SB) on the immune system of mice received 4 Gy total body irradiation(TBI). Methods Thirty male C57BL/6 mice were randomly divided into control group, irradiated group, combined group. The mice in irradiated and combined group received 4 Gy TBI. In combined group, G-CSF(1 μg/each) was intraperitoneally(ip) injected twice one day for 5 days, SB(15 mg/kg) was ip injected every other day after 4 Gy TBI for 5 times. After 4 Gy TBI 10 days, the peripheral bloods were counted, the CD4, CD8, B220 cells in WBC and CD4, CD8 in thymocytes were analyzed by flowcytometry. The reactive oxygen species levels(ROS) of bone marrow cells were detected by microplate reader. Results Compared to the control group, the proportion of CD8, B220 and WBC in the irradiated mice significantly decreased, CD4+CD8+ thymocytes and ROS levels of bone marrow cells increased significantly. Compared to irradiation group, red blood, platelet, CD4 and CD8 cells in peripheral blood, CD4+CD8+ thymocytes decreased in the combined group. Conclusion G-CSF combined with SB has protective effects on the radiation-induced injury in immune system. -
Key words:
- Radiation injuries /
- Granulocyte colony-stimulating factor /
- SB203580 /
- thymocytes /
- peripheral blood
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表 1 粒细胞集落刺激因子联合SB203580给药对4 Gy照射小鼠外周血计数的影响
Table 1. The effects of SB203580 and granulocyte colony-stimulating factor on the peripheral blood of mice received 4 Gy total body irradiation
(x±s) 组别 白细胞数
（109/L）红细胞数
（1012/L）血红蛋白
（g/L）红细胞比容（g/L） 血小板数
（109/L）对照组 6.6±1.2 10.4±0.5 15.5±0.9 0.52±0.03 714±84 照射组 2.1±0.6 9.1±0.4 13.6±0.5 0.46±0.02 301±93 给药组 2.5±0.2 9.5±0.2 14.0±0.4 0.49±0.01 627±161 
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表 2 小鼠外周血白细胞分型
[(x±s)%] Table 2. The peripheral white blood lymphocyte pheno- types in different mice groups
[(x±s)%] 组别 CD4 CD8 B220 对照组 22.1±3.6 21.3±2.2 41.8±9.8 照射组 21.6±5.2 8.6±2.8 9.3±4.4 给药组 35.9±2.3 14.8±3.2 6.1±1.1
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表 3 小鼠胸腺细胞分型
[(x±s)%] Table 3. The thymocyte phenotypes in different mice groups
[(x±s)%] 组别 CD4-CD8- CD4+CD8- CD4-CD8+ CD4+CD8+ 对照组 50.9±3.2 18.2±3.5 8.6±1.6 22.3±4.0 照射组 35.7±1.7 10.9±1.6 5.2±0.9 48.2±1.8 给药组 51.0±3.2 6.2±0.9 3.1±1.0 39.7±2.8
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表 4 小鼠骨髓细胞活性氧水平
Table 4. The reactive oxygen species level in mice bone marrow cells
组别 活性氧（荧光值） 比例（%） 对照组 4252±184 100±4.3 照射组 5767±195 136±4.6 给药组 5444±423 128±10
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[1] 邢志伟, 姜恩海, 王桂林, 等. 《造血刺激因子在急性放射病治疗中的应用规范》解读[J].国际放射医学核医学杂志, 2012, 36(4): 234-237.
[2] Fliedner TM, Graessle DH. Hematopoietic cell renewal systems: mechanisms of coping and failing after chronic exposure to ionizing radiation[J]. Radiat Environ Biophys, 2008, 47(1): 63-69. [3] Greenbaum AM, Link DC. Mechanisms of G-CSF-mediated hematopoieticstem and progenitor mobilization[J]. Leukemia, 2011, 25(2): 211-217. [4] Ryan MA, Nattamai KJ, Xing E, et al. Pharmacological inhibition of EGFR signaling enhances G-CSF-induced hematopoietic stem cell mobilization[J]. Nat Med, 2010, 16(10): 1141-1146. [5] Li D, Wang Y, Wu H, et al. Mitigation of ionizing radiation-induced bone marrow suppression by p38 inhibition and G-CSF administration[J]. J Radiat Res, 2011, 52(6): 712-716. [6] Li D, Wang Y, Wu H, et al. The effects of p38 MAPK inhibition combined with G-CSF administration on the hematoimmune system in mice with irradiation injury[J/OL]. PLoS One, 2013, 8(4): e62921[2013-10-28]. http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0062921. [7] 刘晓冬, 金顺子.辐射免疫学研究[M].吉林:吉林大学出版社, 2005: 8-40.
[8] 赵红霞, 郭梅, 刘铁强, 等. G-CSF对急性辐射损伤小鼠胸腺细胞的细胞周期、增殖细胞及分化的影响[J].中国实验血液学杂志, 2011, 19(3): 809-813.
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