基因治疗是通过转基因技术将某些基因敲除, 将特殊的启动子和目的基因整合到载体或质粒中, 再将载体或质粒直接导入或将质粒包装成病毒后导入病灶, 在病灶微环境的诱导下局限性并持续性地表达目的蛋白, 从而促进或抑制病理过程中一些主要蛋白的合成。在治疗缺血性心脏病的过程中其可最大化地逆转急性心肌梗死的病程发展, 改善心功能并减缓症状的发展, 同时也可为心脏移植供者提供更长的等待时间。

载体是在基因治疗过程中介导基因转入目的细胞的工具。介导基因转入缺血心肌细胞或冠脉的载体很多, 一般可分为病毒载体和非病毒载体, 病毒载体如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒等; 非病毒载体如裸质粒DNA、微导管介导的病毒导入等。病毒载体介导的基因转染效率高, 但其目的基因容量小, 靶向特异性差且存在着一系列的安全问题, 如潜在的致癌性、自身免疫原性等。非病毒载体虽然安全且载体容量无限制, 但是转染效率明显降低。

VEGF可能是目前发现的功能最强、特异性最高的促血管生成因子, 具有促进血管生成、增加血管通透性的活性, VEGF与其受体的相互作用可有效地促进新生血管的形成^[4]。根据外显子剪切的不同, VEGF可分为14种亚型: VEGF111、VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF145b、VEGF148、VEGF162、VEGF-165、VEGF165b、VEGF183、VEGF183b、VEGF189、VEGF189b、VEGF206^[5]。根据基因编码的不同, 哺乳动物VEGF家族分为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子等5种^[6]。

在正常生理和病理条件下, VEGF165被认为是最重要的调节血管生成的因子, 其与血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor-1, VEGFR-1)和VEGFR-2作用诱导血管的生成^[5]。在诱导血管生成的过程中, VEGF165与VEGFR-2的结合发挥着重要的作用, 能引起受体的二聚化和酪氨酸的自身磷酸化, 从而激发酪氨酸激酶的活性, 激活新生血管的生成^[7]。

VEGF165基因可明显地促进心肌梗死大鼠的心肌血管的增生, 改善射血分数^[8-9]。研究显示, 腺病毒介导的基因的异位表达明显高于质粒介导的基因的异位表达, 因此, 质粒介导的VEGF165在治疗心肌血管生成方面可能更有优势^[9]。VEGF165在小鼠的缺血心肌中的应用可有效地增加心肌血管的生成, 促进心室的收缩, 并提高心肌射血分数, 有效地改善心功能^[10]。

HGF由间质细胞分泌, 是促进表皮细胞再生的一种多功能细胞因子。在血管内皮细胞中其与酪氨酸蛋白激酶受体结合促进细胞的转移、增殖, 并能促进蛋白酶的分泌和新生血管的形成^[11]。HGF联合VEGF治疗急性心机梗死的大鼠的研究显示, 二者联合治疗能有效增加缺血心肌部位血管生成, 促进干细胞向缺血区迁移, 同时可以减少缺血心肌纤维化的形成^[12]。

FGF与酪氨酸蛋白激酶受体作用能介导细胞的有丝分裂, 促进细胞的成活, 并且可以促进组织的生长和细胞的转移、增殖和分化^[13]。FGF可以分为多种亚型, 其中, FGF-1和FGF-2可以促进内皮细胞的分化, 并促进其向管状细胞分化。FGF-4和FGF-5主要在细胞内表达, 具有旁分泌和内分泌的作用。在猪体内, FGF-4的基因治疗导致了血管渗漏, 并且加快了梗死后的心肌功能的下降^[14]; 而FGF-5的基因治疗不仅可以改善血液的流动, 而且可以改善心功能, 并促进心肌细胞的分裂再生, 增加心肌血管的生成^[15]。

Ang是近年来发现的一种内皮细胞特异性的促血管生成因子, 包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4等4种亚型, 它们均可与细胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受体结合并发挥作用^[16]。其中, Ang-1可以稳定内皮细胞, 减轻血管渗漏, 对于保护内皮细胞及稳定血管有重要的作用^[17]。

Ang-1和VEGF基因联合治疗猪缺血心肌的实验表明, 单纯的Ang-1基因治疗可以增强心肌的收缩力, 改善心脏充盈^[18]。腺相关病毒介导Ang-1基因的治疗可使猪缺血的心肌室壁厚度增加、梗死区面积缩小^[19]。SonoVue微泡介导的Ang-1基因治疗兔缺血心肌的研究结果显示, Ang-1基因转染缺血心肌可以促进血管新生, 改善局部血供并抑制细胞凋亡, 对急性心肌梗死有治疗作用^[20]。有研究发现, Ang-1能通过激活酪氨酸激酶受体2途径抑制小鼠心肌细胞坏死并促进血管再生^[21]。同时, 腺病毒介导的以肌球蛋白轻链为启动子、Ang-1为治疗基因对猪缺血心肌的治疗研究显示, Ang-1可以诱导血管的生成、促进心肌细胞分化、减少心肌细胞的凋亡、改善心肌灌注和心功能^[22]。

HIF在缺氧条件下的哺乳动物细胞中广泛表达, 但因合成的HIF-1蛋白很快经细胞内氧依赖性蛋白酶降解途径所降解, 因此只有在缺氧的条件下HIF-1才可稳定表达^[23-24]。HIF-1由相对分子质量为12×10⁴的HIF-1α和相对分子质量为(91~94)×10³的HIF-1β两种亚基组成, 每个亚单位都具有碱性的螺旋-环-螺旋结构, 这是其形成异源二聚体并与DNA结合所必需的结构^[25]。HIF-1可以诱导多种基因的表达, 如血管生成相关基因(VEGF基因、基质细胞衍生因子1基因、Ang-2基因、血小板生长因子基因等)^[26]、缺氧代谢相关的基因(包括糖酵解相关基因及胰岛素样生长因子基因)、血管张力相关基因(一氧化氮合成酶基因等)、铁代谢相关的基因(促红细胞生成素基因、转铁蛋白基因等)^[27-28]。HIF-1α可以促进多种血管生成因子及其受体的转录表达, 启动血管新生, 改善缺血的心肌灌注及心功能^[29]。

二甲基乙二酰基甘氨酸是脯氨酸羟化酶的抑制剂, 可以显著增强HIF-1α的活性。有研究在建立的大鼠缺血再灌注损伤模型中注入二甲基乙二酰基甘氨酸, 结果发现HIF-1α的mRNA表达量增多, 心肌梗死面积明显减少, Caspase-3的活性与白细胞介素-8的水平明显降低, 引起了类似延迟缺血预适应的现象, 表明HIF-1α对心肌缺血与再灌注损伤具有重要的保护作用^[30]。特意性敲除小鼠心肌细胞的HIF-1α基因, 发现小鼠促血管生成因子表达水平下调, 毛细血管密度下降, 心脏收缩和舒张功能下降^[31]。转基因HIF-1小鼠与非转基因的小鼠比较, 转基因小鼠多生成了约66%的毛细血管, 且血管密集功能正常, 没有出现类似VEGF促进生成的毛细血管发生血管渗漏的现象^[32]。Shyu等^[33]研究发现, 将含有HIF-1α/VP16(其中, VP16为一种单纯疱疹病毒Ⅰ型囊膜蛋白)基因的质粒注入大鼠急性缺血心肌中能有效地减少心肌梗死面积并增加血管的生成。Dong等^[34]的研究显示, 白细胞中HIF-1α表达下调可减少白细胞向急性缺血心肌聚集, 从而促进缺血心肌的心室重构, 改善心功能。

虽然基因治疗在治疗缺血性心脏病中存在着很多优势, 但是应用于临床时也存在很多风险, 如导入的外源基因在靶器官内的表达时间短; 病毒载体介导基因转染后, 病毒基因整合入人体细胞基因组, 引起插入突变; 促血管生成因子过表达引起心肌血管瘤; 同一基因治疗在不同患者中的疗效存在很大差异等。尽管临床实验显示出基因治疗的安全性, 但是其长期安全性还需要进一步的验证。这就需要我们进行长期、大规模、随机、对照、双盲的临床试验, 选取更多的患者进行统计分析, 确定哪一种病情更适合于哪一种基因治疗, 并发现每一种基因治疗可能存在的潜在危险和不良反应。

在过去的几十年里, 大量学者不断致力于基因治疗在缺血性心脏病中的前期临床研究, 在缺血性心脏病动物体内已取得了很多可喜的成就。寻找更适合进行治疗的基因和载体、避免基因引起的不良反应、确定基因治疗的最佳方法等还有待于进一步的研究和探索。随着医学分子生物学的发展, 缺血性心脏病基因治疗加速发展, 相信在不久的将来, 基因治疗很快就会成为人类治疗缺血性心脏病的新方法, 为严重缺血性心脏病且不适合传统治疗的患者带来新的希望。