长期研究发现，原发性前列腺癌患者10年内的复发率高达30%^[1]。雄激素全阻断治疗是目前针对中晚期前列腺癌的主要治疗方法，但由此而导致的雄激素非依赖细胞的出现成为前列腺癌治疗的主要挑战之一^[2]。近年来的研究结果表明，癌干细胞是肿瘤细胞的来源，具有自我更新能力，有能力形成异质性肿瘤^[3]，在肿瘤的起始与形成中起着关键作用。癌干细胞很可能表达抗凋亡与抗药基因，使其不受传统治疗方法的影响^[4-5]，从而引起肿瘤的复发与转移，为了彻底根除肿瘤，就必须靶向治疗癌干细胞。

目前关于哪种前列腺细胞是前列腺癌的细胞起源尚未明确，主要存在两种观点：一种认为腺分泌性上皮细胞是前列腺癌的细胞起源；另一种认为基底上皮细胞是前列腺癌的细胞起源。腺分泌性上皮细胞表达细胞因子8和18、雄激素受体（androgen receptor, AR）、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase, PAP）与15-脂氧合酶2，具有雄激素依赖性，需要雄激素维持其生长。而基底上皮细胞则在组织学上较腺分泌性上皮细胞更深一层，表达细胞因子5、CD44、Bcl-2（一种细胞凋亡相关蛋白）、P63、端粒酶、谷胱甘肽巯基转移酶k，是雄激素非依赖性细胞，能在雄激素剥夺情况下生长^[6]。目前普遍认为，基底上皮细胞是前列腺癌上皮细胞的起源，从人前列腺癌组织样本的基底细胞中能成功分离出CD44⁺α2β1^hiCD133⁺细胞；鼠Lin^-Sca-1⁺CD49f^hi（其中，Lin、Sca-1、CD49f均是细胞表面标志物）型基底细胞移植后能形成腺分泌性上皮细胞；取自人良性前列腺组织的基底细胞还可在免疫缺陷鼠体内形成前列腺癌^[7]。Goldstein等^[8]从人良性前列腺组织中分离出基底细胞与分泌细胞，用肿瘤基因转变它们，将这些细胞移植到小鼠体内，发现是基底细胞而非分泌细胞产生了与人体前列腺肿瘤极相似的前列腺肿瘤。此外，目前普遍认为前列腺癌的产生、复发与转移的根源是前列腺癌干细胞，所以前列腺癌干细胞也很可能位于基底上皮细胞内。雄激素会引起敏感细胞的凋亡，但却能提高一小部分细胞的抵抗性，即基底细胞中的前列腺癌干细胞^[9]。以上研究表明，前列腺癌干细胞在前列腺癌中起着关键作用，必须有效地分离前列腺癌干细胞才能对其展开更深入的研究。

基于正常干细胞与癌干细胞的相似性，人们认为是正常前列腺干细胞的致癌性转化产生了前列腺癌干细胞，两者具有生物相似性，还可能共表达某些标志物，人们常利用这些标志物来分离前列腺干细胞和前列腺癌干细胞。但目前的迫切任务还是如何有效地分离前列腺癌干细胞。首先需要明确癌干细胞与正常干细胞的区别，正常干细胞的数量是恒定的，只有在组织受损时才会增多；而癌干细胞则随肿瘤的生长而增多，癌干细胞具有自我更新能力，且能产生异质性瘤细胞群体，具有更高的成瘤性。此外，癌干细胞分裂缓慢、生长周期长，这些特性使其能够逃避放化疗的刺激，引起癌症的复发与转移。更重要的是，癌干细胞能够将药物泵出胞外，使其免受传统药物治疗的影响^[10]。正常前列腺干细胞被认为是AR^-型，能够产生前列腺上皮细胞系。与其相似，前列腺癌干细胞也不表达AR，然而它们能够在体内重建AR⁺肿瘤细胞群体，所以癌干细胞能在雄激素剥夺环境下继续扩张，并使其具有对传统治疗的抵抗性及复发的能力。目前促进基底上皮细胞和分泌性上皮细胞AR表达的信号通路尚未明确^[3]。前列腺癌干细胞特异性标志物也尚未明确，但前列腺癌干细胞表面表达的CD44、CD133、α2α6整合素、c-met（一种具有受体酪氨酸激酶活性的蛋白）、CD166、乙醛脱氢酶1等与癌干细胞增殖、成瘤、侵袭和转移相关的标志物可能更多些。目前分离前列腺癌干细胞的方法主要有两大类，分别是基于前列腺癌干细胞的表面标志物和癌干细胞的生物学特性进行分选，所采用的细胞系多为PC3、LNCaP和DU145等。

FACS又称流式细胞分选，是以目的细胞的特异性标志物为基础，用带荧光标记的特异抗体孵育细胞后上机检测，荧光经流式细胞仪激光激发来分选带荧光标记的目的细胞的方法。在过去的40年中，流式细胞术一直在多重细胞群体中个别类型细胞的高分辨率分选实验中居于领导地位，其分辨率高，极具应用价值，可通过细胞表面的标志物进行分选，也可根据胞内化合物进行分选^[11]。但由于目前前列腺癌干细胞的特异性标志物尚未明确，研究者们主要通过前列腺干细胞的标志物来分离前列腺癌干细胞，并通过将较小数量的细胞移植到有免疫功能的动物模型体内，通过观察其成瘤性来分析其干细胞特性^[12-14]。目前常用的标志物包括CD44、Sca-1、CD133、ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）和整合素等^[3]，其中，CD44、整合素α2β1及CD133是目前应用最广的。Patrawala等^[15]采用FACS技术从多种前列腺癌细胞系中分离了CD44⁺和CD44^-细胞，并比较了它们在体内外的成瘤性，发现CD44⁺细胞具有高增殖、高克隆、高成瘤和高转移特性，且CD44⁺细胞拥有干细胞的本质属性，CD44⁺细胞中干细胞基因（如Oct-3/4、B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点基因、β-连环蛋白基因和精胺氧化酶基因）的mRNA呈高水平表达，CD44⁺细胞可以产生CD44^-细胞，AR^-的CD44⁺细胞可以分化成AR⁺肿瘤细胞，且CD44⁺细胞呈不对称分裂，该研究证明CD44⁺细胞可能为前列腺癌干细胞。此外，还有研究表明，以CD44⁺α2β1^hiCD133⁺为标志物从人前列腺癌活检组织中分离出的基底癌干细胞，可以在体外自我更新，在分化条件下培养时还发现其可产生AR⁺PAP⁺CK18⁺（其中，CK18为细胞角蛋白18）腺上皮细胞，表明它们可能为原始的细胞群体^[10]。通过α2β1^hi/CD133⁺富集的亚细胞群具有高增殖潜力，拥有体外高克隆形成能力，在免疫缺陷鼠体内还可重建功能性前列腺腺体，并可分化为可表达AR、前列腺特异性抗原的腺上皮细胞。最近，Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺也被研究者用来纯化鼠前列腺干细胞，将纯化的干细胞进行体内移植后会重建功能性前列腺组织。此外，Trop2⁺CD44⁺CD49f⁺（其中，Trop2为一种细胞表面糖蛋白）也被用来鉴定基底干细胞，此类细胞具有前列腺悬浮细胞球高形成能力及组织再生能力。也有学者利用乙醛脱氢酶1活性来分离前列腺干细胞^[3]。Jiao等^[16]最近研究发现CD166在前列腺癌中高表达，尤其是在激素难治性前列腺癌中，其富集的Lin^-Sca-1⁺CD49f^hiCD166^hi细胞群具有更强的悬浮细胞球形成能力，表明CD166为前列腺癌干细胞标志物，且还极可能为前列腺癌干细胞的特异性标志物，可用于分离及鉴定前列腺癌干细胞。流式分选具有高速度、高灵敏度、高精度、高纯度及多参数等优点，且分选较为简捷，在前列腺癌干细胞分选方面有着巨大潜力，但由于其是基于前列腺癌干细胞标志物而进行的分选，故目前还需在前列腺癌干细胞特异性标志物方面展开更深入的研究，以加快FACS富集前列腺癌干细胞的步伐。

MACS又称免疫磁珠分选，是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合的原理，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该特异性表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离，获取所需目的细胞。Sheng等^[17]通过CD133⁺/CD44⁺ MACS技术对PC-3细胞进行分选后发现，CD133⁺和CD44⁺细胞分别占到了99.09%和99.88%，而分离前其比例仅为0.51%和0.31%，其又用无血清培养基（serum free medium，SFM）法培养CD133⁺/CD44⁺细胞，发现细胞并不会凋亡，而会形成可折射光、紧密的悬浮细胞球，经流式细胞分析发现，CD133⁺和CD44⁺细胞分别占到了84.8%和99.82%，与MACS所分离细胞的比例相近，且CD44⁺细胞比例几乎相等。研究者通过蛋白质印迹分析发现，经转化生长因子β诱导分化的悬浮细胞球和CD133⁺/CD44⁺细胞能够表达PAP和AR，而未经诱导的对照组则无PAP和AR表达。研究证明MACS和SFM可有效分离前列腺癌干细胞，并可为该方面研究提供稳定的前列腺癌干细胞来源。此外，Castellón等^[18]以前列腺癌患者的临床活组织为标本，并以CD133⁺/CD44⁺/ABCG2⁺/CD24^-为标志物经MACS也分选到了前列腺癌干细胞，且研究证明前列腺癌干细胞标志物的表达与前列腺癌患者的病理分期和癌症转移相关。MACS技术是德国美天旎生物技术有限公司的专利产品，该方法操作简便，25~30 min内即可完成，特异度高，且操作过程中无污染，对细胞伤害小，得到的细胞的生物学活性和功能不受影响，可用于后续实验^[19]。FACS和MACS两种方法的分离效率几乎相同，但由于FACS的强剪切力、强激光损伤及高压力等物理性过程会对细胞产生一定损伤，不利于细胞的后续培养^[20]。故如果前列腺癌干细胞特异性标志物能够明确，则MACS可谓具有极大的优越性，可有效分离前列腺癌干细胞。

最新研究发现，根据干细胞的侧群特性也可富集前列腺癌干细胞，癌干细胞表面的ATP结合盒转运子超家族（尤其是ABCG2）能将结合DNA的Hoechst 33342荧光染料泵出胞外，据此再与FACS技术联合可分离前列腺癌干细胞，癌干细胞的这一特性使其具有抗药性。罗勇等^[21]通过CD133⁺CD44⁺表型行FACS及SP Hoechst染料实验同时分离Du145、IA8、LNCaP、TSU-Pr及PC-3等5种前列腺癌细胞中的癌干细胞，并对其增殖潜力及成瘤能力进行测定，结果发现CD133⁺CD44⁺在5种前列腺癌细胞中所占比例均很小，而SP细胞在Du145、IA8、LNCaP、TSU-Pr中所占比例很高，但在PC-3中未检测到，LNCaP/SP比LNCaP/NSP（其中，NSP为non-side population）细胞高表达整合素α2、Nanog（一种胚胎干细胞关键蛋白）、CD44、OCT4（一种干细胞相关蛋白）及ABCG2，更具侵袭力及增殖力，表明SP细胞分选比目前所采用的CD133⁺CD44⁺流式分选更适于富集前列腺癌干细胞，且LNCaP/SP细胞可能为前列腺癌干细胞群体的典型代表。殷波等^[22]通过SP细胞分选技术从DU145细胞中分离出了1.1%的SP细胞，将其培养于SFM中时会成簇生长，经RT-PCR检测这些SP细胞发现其较母系DU145细胞高表达ABCG2，表明这些细胞具有干细胞特性。Chen等^[23]利用干细胞SP特性经FACS分别从TSU、PC3、LNCaP中提取到1.6%、0.8%、0.6%的SP细胞，并对TSU/SP细胞进一步分析发现，TSU/SP细胞较TSU/NSP细胞具有更强的克隆形成能力，且能形成更坚固、更紧密的单克隆细胞群体，相反，TSU/NSP细胞形成的克隆群体则更小更分散，表明SP细胞在肿瘤的自我更新及增殖中起着关键作用，可能是前列腺癌干细胞。他们随后又进行了SP细胞鼠内移植成瘤实验，发现仅需1×10⁴个SP细胞即可在鼠体内成瘤，而NSP细胞则需5×10⁶个细胞，且SP细胞所形成的肿瘤更大，以上结果均表明SP细胞具有很强的成瘤能力，保留了前列腺癌干细胞的相关特性。但是，Platet等^[24]发现取自大鼠C6脑胶质瘤细胞的SP细胞可以产生NSP细胞，相反NSP细胞也可以产生SP细胞，且NSP细胞拥有与SP细胞相同的成瘤性，因此在很多肿瘤中可以通过SP细胞分选来分离癌干细胞，但需注意的是SP细胞内包含干细胞，但SP细胞并不等同于干细胞，干细胞也可能存在于NSP细胞中。目前，SP细胞分选是筛选肿瘤干细胞常用的方法，但该方法也有局限性，Hoechst33342是一种DNA合成抑制剂，存在细胞毒性，且此方法并不稳定，很多因素会对SP细胞的分离鉴定产生影响，但当无法确定前列腺癌干细胞的表面特异性标志物时，它仍然是前列腺癌干细胞分离的有效方法之一，且比较实用，可用来分离前列腺癌干细胞并对其进行更深入的研究，此外，探讨其他更有效的分离方法也极为重要^[25]。

目前还有人采用体外SFM悬浮细胞聚球法来富集前列腺癌干细胞，此方法并不需要以前列腺癌干细胞标志物为基础，SFM可以使癌干细胞保持在未分化状态，使其在SFM中呈悬浮细胞聚球生长，据此来分离前列腺癌干细胞。Fan等^[26]认为流式细胞分选及SP细胞分选技术所分离的癌干细胞数量极少，阻碍了前列腺癌干细胞的分离纯化，而获得足够数量的前列腺癌干细胞是前列腺癌干细胞靶向治疗的关键，他们通过体外SFM悬浮细胞聚球法培养人前列腺癌细胞系PC3和LNCaP，并利用SP细胞分选技术、药敏实验和前列腺癌干细胞分子标志物分析来鉴定其干细胞特性。结果发现PC3悬浮细胞聚球中CD44⁺/CD133⁺细胞的数量是黏附PC3细胞中CD44⁺/CD133⁺细胞的18倍（13.94% vs. 0.77%），SP细胞数占到3.1%，但黏附细胞中未检测到SP细胞，悬浮细胞球的抗铂化合物能力明显高于黏附细胞，而LNCap在同样的培养环境下不能形成悬浮细胞球，表明此法可用于富集前列腺癌干细胞。Zhang等^[27]通过悬浮细胞球培养法培养人前列腺癌细胞系LNCaP、22RV1、DU145和PC3，发现悬浮细胞球的自我更新能力、抗药性和肿瘤形成能力均高于黏附细胞，此外，这些细胞的干细胞基因Gli1（一种Hedgehog信号通路下游转录因子）、ABCG2、B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1基因还呈高水平表达。张波等^[28]和李奎庆等^[29]用SFM（成分为DMEM/F12培养基+20 g/L表皮生长因子+0.05 g/L胰岛素+4 g/L牛血清白蛋白+2%B27）培养人前列腺癌细胞系PC3和LNCap，发现其在5~10 d内可形成悬浮细胞球，且能传代，表明这些细胞具有自我更新及无限增殖能力，经流式鉴定其中含有较低比例（0.5%~15%）的CD44⁺/CD133⁺及SP细胞，且当用SFM与含血清培养基（serum-supplied medium，SSM）交替培养时，可实现其与贴壁细胞的相互转化，表明这些细胞具有分化能力，但李奎庆等^[29]的研究表明，SSM培养LNCap和PC3时也可形成悬浮细胞球，与SFM间差异无统计学意义，且采用SSM法的周期更短，能更有效地分离癌干细胞，SSM法是否也可用来分离前列腺癌干细胞还需进一步研究。以上结果均表明，悬浮细胞球培养法可以有效地分离前列腺癌干细胞，与目前常用的免疫磁珠分选等方法相比，不仅花费少，且技术简便，肿瘤干细胞的富集率高而且稳定，这将为前列腺癌干细胞的生物学特性研究与前列腺癌新治疗策略的开发提供极大便利。

综上，目前前列腺癌干细胞的分离与鉴定尚处于细胞水平，且由于前列腺癌干细胞特异性标志物尚未明确，FACS和MACS技术主要通过可能为前列腺癌干细胞特异性标志物的前列腺干细胞表面标志物进行分选，此外，由于不同类型前列腺癌的癌干细胞标志物可能存在差异，FACS和MACS技术还尚未成熟，故SP细胞分选及SFM悬浮细胞聚球分选在前列腺癌干细胞分离领域得到了广泛推广及研究，而这两种方法虽未采用FACS和MACS技术，但最终均需根据前列腺癌干细胞的标志物及其特性来进行结果鉴定。此外，通过各方法所富集的亚细胞群是否能代表人体内的前列腺癌干细胞还有以下3点需考虑：①由初始癌细胞而非癌细胞系富集的癌干细胞才最能代表前列腺癌干细胞，然而由于技术及临床等的限制，很难得到初始癌细胞；②体外培养的细胞并非在体内环境下成长，在长期培养过程中，很可能发生了基因突变；③体外培养的细胞很可能失去了其原始分化潜能，不能很好地代表初始前列腺癌干细胞^[7]。所以对初始癌细胞的干细胞分选很重要，由于前列腺癌干细胞特异性标志物的不确定性，不能有效地分离前列腺癌干细胞，为前列腺癌干细胞的研究及药物筛选带来了很大困难，阻碍了现代肿瘤学的发展。故要想有效富集前列腺癌干细胞，还需加快其标志物方面研究工作的步伐，将前列腺癌干细胞分选与其特异性标志物的研究相结合，将为有效分离前列腺癌干细胞带来极大便利，也将为根治前列腺癌提供更好的研究平台。