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DNA双链断裂（double-strand break，DSB）是射线等外源性因素致DNA损伤中最严重的一种类型，机体为维护基因组的完整性，可启动两种不同的途径对DSB进行修复[1]：非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）途径和同源重组（homologous recombination，HR）途径。虽然两者在修复DSB中均发挥着重要作用，但也存在着竞争和协同作用[2]。Ku70（一种NHEJ蛋白）和Rad51（一种HR修复蛋白）分别是NHEJ和HR中的重要组成蛋白。本研究以Ku70为靶点，通过调控Ku70蛋白表达水平来观察其对Rad51蛋白表达的影响，以期为研究NHEJ与HR的相互作用提供帮助。
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人胃腺癌细胞系SGC7901和人食管癌细胞系EC109为本实验室保存，人非小细胞肺癌细胞系H460由中国医学科学院生物技术研究所白利平博士惠赠，以上3种细胞系均采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（美国Gibco公司）在37 ℃、5% CO2条件下常规培养。真核细胞Ku70表达质粒PGCsi3.0-hKu70由本实验室构建，采用LipofectamineTM 2000转染试剂（美国invitrogen公司）进行肿瘤细胞瞬时转染。
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肿瘤细胞均置于137Cs γ源（加拿大原子能有限公司）下照射，源靶距为30 cm，剂量率为0.793 Gy/min，照射吸收剂量为4 Gy。照射后细胞继续培养。
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为观察Ku70蛋白对Rad51蛋白表达水平的影响，实验分为4组，分别为空白对照组、单纯照射组（经4 Gy γ射线照射后48 h的细胞）、靶向Ku70基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）单纯转染组（靶向Ku70基因siRNA转染48 h后的细胞）、靶向Ku70基因siRNA转染联合照射组（先经靶向Ku70基因siRNA预处理48 h，再经4 Gy γ射线照射后48 h的细胞）。
为证实Ku70蛋白对Rad51蛋白的调控作用，按照PGCsi3.0-hKu70分别瞬时转染EC109、H460和SGC7901 3种肿瘤细胞后持续时间的不同，分为转染后6 h组、48 h组、72 h组和空白对照组。
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当细胞生长至亚融合状态时收集细胞，用细胞裂解液（美国Pierce公司）裂解细胞。蛋白定量操作按二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒（日本Takara公司）说明书进行。取50 μg蛋白进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的tris-buffered saline and tween 20（TBST）缓冲液中4 ℃封闭过夜，加入一抗Anti-Ku70（英国abcam公司，1:1000稀释）、Anti-Rad51（美国sant cruz公司，1:1000稀释），室温下孵育2 h，洗膜，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（武汉博士德生物工程有限公司，1:3000稀释），室温下孵育1 h，采用电致化学发光法检测蛋白表达情况。以β-actin作为内参蛋白。采用Quantity One软件分析条带灰度值。
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靶向Ku70基因siRNA对肿瘤细胞Rad51蛋白表达水平的影响结果见图 1，SGC7901、EC109和H460 3种肿瘤细胞经γ射线照射后Rad51蛋白表达水平均较空白对照组明显升高；靶向Ku70基因siRNA单纯转染组Rad51蛋白表达水平较空白对照组明显下降；靶向Ku70基因siRNA转染联合照射组肿瘤细胞的Rad51蛋白表达水平较靶向Ku70基因siRNA单纯转染组没有升高。
图 1 靶向Ku70基因小干扰RNA对Rad51蛋白表达水平的影响 图中，1a：人非小细胞肺癌H460细胞系；1b：人食管癌EC109细胞系；1c：人胃腺癌SGC7901细胞系。其中，Ku70：一种非同源末端连接蛋白；Rad51：一种同源重组修复蛋白。
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Ku70蛋白高表达对Rad51蛋白表达水平的影响结果见图 2，随着PGCsi3.0-hKu70质粒转染后时间的延长，Ku70蛋白的表达水平也逐渐升高，而Rad51蛋白表达水平也随之升高，且3种细胞系均表现相同。
图 2 转染真核细胞Ku70表达质粒PGCsi3.0-hKu70后不同时间Ku70蛋白高表达对Rad51蛋白表达水平的影响 图中，2a：人非小细胞肺癌H460细胞系；2b：人食管癌EC109细胞系；2c：人胃腺癌SGC7901细胞系。其中，Ku70：一种非同源末端连接蛋白；Rad51：一种同源重组修复蛋白。
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DSB修复与放射敏感性密切相关，抑制DSB修复是肿瘤放疗增敏的主要手段之一。因此，明确HR与NHEJ 2种修复方式间的相互作用，对于靶向增强肿瘤的放射敏感性具有一定的指导作用。
HR与NHEJ间既存在着相互竞争，也存在着相互协同作用。这种协同作用最突出的表现就是二者在胚胎脑发育中的作用，Orii等[3]的研究表明，干扰HR将促进增殖早期神经细胞的凋亡，而干扰NHEJ则导致有丝分裂后期细胞凋亡的增加；对HR和NHEJ双突变分析的结果显示，分属HR和NHEJ 2种蛋白（Rad54和Ku80[4]、Rad54和ligase Ⅳ[5]）双缺失所引起表象的改变程度要远远大于其中一种蛋白的单缺失。以上研究表明，HR和NHEJ在DSB修复中发挥着协同作用。但具体的协同作用机制目前尚不明确。
在真核细胞中，NHEJ首先由Ku70/Ku80异二聚体结合到断裂处，然后招募其他蛋白完成断裂处的连接。在HR过程中，必须由Rad51蛋白结合到产生的单链上才能寻找到配对的同源序列完成修复。因此，Rad51和Ku70蛋白分别是HR和NHEJ的重要蛋白。本研究以Ku70和Rad51蛋白为靶点，研究了NHEJ对HR的调控作用，结果表明，靶向Ku70基因siRNA可抑制Rad51蛋白的表达，并对辐射诱导的Rad51蛋白表达水平的升高也具有抑制作用。Ku70对Rad51具有正调控作用。但本研究也存在一定的局限性，因为Rad51蛋白的表达是受细胞周期调控的[6-7]，因此，笔者的后期研究将观察在不同细胞周期中Ku70对Rad51的调节作用，以期进一步明确两者间的相互作用。
Ku70对同源重组修复蛋白Rad51的调节作用
Regulation of homologous recombination repair protein Rad51 by Ku70
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摘要:
目的 研究非同源末端连接(NHEJ)蛋白Ku70对同源重组(HR)修复蛋白Rad51的调节作用，初步探讨HR与NHEJ间协同作用的机制。 方法 采用Western blot法观察特异性增高和降低Ku70蛋白水平后Rad51蛋白表达水平的变化情况。 结果 靶向Ku70基因小干扰RNA(siRNA)单纯转染组Rad51蛋白的表达水平较空白对照组明显下降；Ku70高表达载体PGCsi3.0-hKu70转染肿瘤细胞后，随着Ku70表达水平的升高，Rad51水平也随之升高。 结论 Ku70可能对Rad51有正调控作用，NHEJ可能通过Ku70对Rad51的调节来实现其与HR的协同作用。 Abstract:Objective To explore the regulative effect of non-homologous end joining(NHEJ)protein Ku70 on homologous recombination repair protein Rad51, and to investigate the synergistic mechanism of homologous recombination repair in combination with NHEJ. Methods Observed Rad51 protein expression after transfect Ku70 small interfering RNA or Ku70 plasmid DNA into tumor cells using Western blot. Results Expression of Rad51 was obviously reduced after pretreated with Ku70 small interfering RNA. And with the increasing expression of Ku70 protein after transfection of Ku70 plasmid DNA PGCsi3.0-hKu70 into tumor cell lines, the Rad51 protein expression was increased. Conclusion Ku70 protein has regulating effect on gene expression of Rad51, and it might participate in the collaboration between homologous recombination repair and NHEJ. -
Key words:
- DNA repair /
- Rad51 recombinase /
- RNA, small interfering /
- Ku70
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图 1 靶向Ku70基因小干扰RNA对Rad51蛋白表达水平的影响 图中，1a：人非小细胞肺癌H460细胞系；1b：人食管癌EC109细胞系；1c：人胃腺癌SGC7901细胞系。其中，Ku70：一种非同源末端连接蛋白；Rad51：一种同源重组修复蛋白。
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[1] Mao Z, Bozzella M, Seluanov A, et al. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle, 2008, 7(18):2902-2906. doi: 10.4161/cc.7.18.6679 [2] Kass EM, Jasin M. Collaboration and competition between DNA double-strand break repair pathways. FEBS Lett, 2012, 584(17):3703-3708. [3] Orii KE, Lee Y, Kondo N, et al. Selective utilization of nonhomologous end-joining and homologous recombination DNA repair pathways during nervous system development. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(26):10017-10022. doi: 10.1073/pnas.0602436103 [4] Couëdel C, Mills KD, Barchi M, et al. Collaboration of homologous recombination and nonhomologous end-joining factors for the survival and integrity of mice and cells. Genes Dev, 2004, 18(11):1293-1304. doi: 10.1101/gad.1209204 [5] Mills KD, Ferguson DO, Essers J, et al. Rad54 and DNA Ligase Ⅳ cooperate to maintain mammalian chromatid stability. Genes Dev, 2004, 18(11):1283-1292. doi: 10.1101/gad.1204304 [6] Deckbar D, Jeggo PA, Löbrich M. Understanding the limitations of radiation-induced cell cycle checkpoints. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2011, 46(4):271-283. doi: 10.3109/10409238.2011.575764 [7] Suwaki N, Klare K, Tarsounas M. RAD51 paralogs:roles in DNA damage signalling, recombinational repair and tumorigenesis. Semin Cell Dev Biol, 2011, 22(8):898-905. doi: 10.1016/j.semcdb.2011.07.019 -
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图(2)
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