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IRM-2小鼠是我所培育的近交系小鼠品系，我们通过对IRM-2小鼠及其亲本ICR小鼠与615小鼠比较，结果发现，IRM-2小鼠突出的生物学特性是具有较强的辐射抗性[1]。通过mRNA差异显示分析已获得的21条表达序列标签与已知小鼠基因非同源[2]，提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因和某种保护机制。本研究从构建的全长IRM-2小鼠cDNA文库[3]测定cDNA克隆的序列，对得到的全长cDNA进行功能鉴定，分析全长cDNA在IRM-2小鼠辐射抗性中发挥的作用，从分子水平上揭示抗辐射特性的本质。
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小鼠胚胎成纤维细胞由本实验室原代培养[4]，共济失调性毛细血管扩张症（ataxia telangiectasia，AT）5B1VA细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。质粒小提试剂盒和琼脂糖由美国Promega公司提供，TRizol试剂、pDNR-lib载体和pGM-T载体由美国Invitrogen公司提供，21对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，大肠杆菌E.coli DH5α由北京天根生化科技有限公司提供，Rediprime Ⅱ Random Prime Labelling System和杂交液由美国Amersham Biosciences公司提供。主要仪器有PCR仪（美国MJ公司）真空印迹装置和Gel Doc 1000凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），137Cs γ射线照射源由加拿大Nurdion公司提供，紫外分光光度计由美国Beckman公司提供。
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在已构建好的全长IRM-2小鼠cDNA文库中[3]混合从甘油菌中抽提的质粒，根据已知的21条表达序列标签部分序列设计21对引物[5]，以文库质粒pDNR-lib为模板，分别与pDNR-lib载体上多克隆位点两侧的通用引物M13+和M13-配对进行PCR扩增全长。PCR扩增条件为94 ℃ 30 s，40 ℃ 2 min，72 ℃ 30 s，30个循环。
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切胶回收PCR产物中500~1000 bp片段，纯化PCR产物，将PCR产物连接入pGM-T载体，转化DH5α感受态大肠杆菌，经氨苄、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷筛选，挑取阳性克隆进行培养并抽提质粒，使用pGM-T载体通用引物T7、SP6进行测序。
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使用Phred软件去除低质量序列和屏蔽载体序列，使用Phrab软件进行拼接，导出拼接序列。将拼接序列放入GenBank数据库进行比对，寻找同源序列信息，对获得的5条全长cDNA（随机编号为1~5号）克隆进行序列分析。
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培养IRM-2小鼠、亲代ICR小鼠和615小鼠胚胎成纤维细胞至对数生长期，经6.5 Gy γ射线照射后提取总RNA，对30 μg总RNA进行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，将凝胶真空印迹转至尼龙膜上。按Rediprime Ⅱ Random Prime Labelling System的说明书上的操作步骤，用1.85 MBq32P脱氧胞苷三磷酸标记的文库筛选时使用的特异引物的PCR产物为探针，进行Northern blot杂交，以β-actin（北京中杉金桥公司）为内参。用2×SSC（主要成分为氯化钠和柠檬酸钠），0.1%十二烷基硫酸钠洗膜后，将膜放在暗盒里进行放射自显影，洗片。用Doc1000凝胶成像系统采集图像，用Molecular AnalysisTM软件分析DNA条带分布及灰度关系。
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将全长cDNA克隆至pMD20-T表达载体，转染AT5B1VA细胞。待AT5B1VA细胞处于对数生长期时，胰酶消化后将细胞接种于100 mm培养皿中，每皿3000个细胞。待细胞贴壁后进行6.5 Gy γ射线照射，将培养皿置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养14 d，可观察到有克隆形成。倒去上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤，加入75%甲醇固定液固定5 min。弃去固定液，加入0.5%结晶紫染色液（北京普博欣公司）染色5 min，在显微镜下计数克隆，以每团细胞数大于50个时作为一个克隆。克隆形成率（%）=集落数/接种细胞数×100%
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采用SPSS 16.0软件进行方差分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
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IRM-2小鼠、亲代ICR小鼠和615小鼠胚胎成纤维细胞经6.5 Gy γ射线照射后，全长cDNA表达水平由高到低的顺序是4号、5号、2号、1号、3号。IRM-2小鼠4号、5号和2号cDNA表达水平均高于其亲本ICR小鼠和615小鼠，其中IRM-2小鼠2号cDNA表达水平显著高于其亲本ICR小鼠和615小鼠（F=20.17，P＜0.05；F=25.19，P＜0.05）；IRM-2小鼠与其亲本ICR小鼠和615小鼠相比，1号和3号cDNA表达无明显差异，见图 1。
图 1 5条全长cDNA在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达
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经6.5 Gy γ射线照射后，4号cDNA细胞存活率最高（18%），5号次之（16%），2号居中（11%），1号和3号最低（2%~3%），见图 2。结果提示，4号、5号和2号cDNA具有较强的抗辐射功能。
图 2 5条全长cDNA转染后共济失调性毛细血管扩张症5B1VA细胞的存活率
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自20世纪70年代首例cDNA克隆问世以来，从cDNA文库中获得全长cDNA和大规模测序发掘新基因是目前cDNA文库最广泛的用途[6-8]。目前国内外文献常常通过分析照射后差异表达基因的变化来研究基因的抗辐射功能[9-11]。我们在前期研究中通过mRNA差异显示获得与已知小鼠基因非同源的21条表达序列标签，从构建的全长IRM-2小鼠cDNA文库中获得了5条全长cDNA序列。经与GenBank数据库进行比对，发现与小鼠已知基因不同源。通过预测可能编码蛋白质的氨基酸序列，得到5条全长cDNA编码蛋白质的性质[4]。
本研究中我们用全长cDNA转染AT5B1VA细胞，经照射后发现4号、5号和2号cDNA细胞存活率较高。小鼠胚胎成纤维细胞经照射后发现，IRM-2小鼠4号、5号和2号cDNA表达水平均高于其亲本ICR小鼠和615小鼠。全长cDNA表达水平和抗辐射功能的结果均提示4号、5号和2号cDNA具有较强的抗辐射功能。
利用全长cDNA文库不仅能获得目的基因完整的序列和功能信息，还有利于后期蛋白质表达及功能分析。我们获得的全长cDNA为从分子水平上揭示IRM-2小鼠抗辐射特性的本质奠定了基础。下一步我们将把具有抗辐射功能的4号、5号和2号cDNA导入到辐射敏感小鼠中，观察小鼠是否具有抗辐射特性。同时检测小鼠体内4号、5号和2号cDNA编码蛋白的表达水平，希望通过数据库能检索到人类同源蛋白。辐射敏感性研究一直是放射生物学领域的研究热点[11-12]，辐射抗性相关基因的发现将对辐射损伤及其修复机制研究提供新的理论依据。
抗辐射小鼠cDNA文库的全长cDNA功能鉴定
The function analysis of full-length cDNA sequence from IRM-2 mouse cDNA library
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摘要:
目的 鉴定IRM-2小鼠cDNA文库的全长cDNA功能。 方法 以IRM-2小鼠的21条表达序列标签为引物进行PCR，从IRM-2小鼠全长cDNA文库中测定cDNA克隆的序列。观察小鼠胚胎成纤维细胞经6.5 Gy γ射线照射后全长cDNA的表达和全长cDNA转染对辐射敏感细胞共济失调性毛细血管扩张症（AT）5B1VA细胞生长的影响。 结果 小鼠胚胎成纤维细胞经照射后，IRM-2小鼠4号、5号和2号cDNA表达水平均高于其亲本ICR小鼠和615小鼠。将全长cDNA转染AT5B1VA细胞，经照射后4号、5号和2号cDNA细胞存活率较高。 结论 IRM-2小鼠4号、5号和2号全长cDNA具有较强的抗辐射功能。 Abstract:Objective To identify the function of full-length cDNA sequence from IRM-2 mouse cDNA library. Methods Full-length cDNA products were amplified by PCR from IRM-2 mouse cDNA library according to twenty-one pieces of expressed sequence tag. The expression of full-length cDNAs were detected after mouse embryonic fibroblasts were exposed to 6.5 Gy γ-ray radiation. And the effect on the growth of radiosensitivity cells AT5B1VA transfected with full-length cDNAs was investigated. Results The expression of No.4, 5 and 2 full-length cDNAs from IRM-2 mouse were higher than that of parental ICR and 615 mouse after mouse embryonic fibroblasts irradiated with γ-ray radiation. And the survival rate of AT5B1VA cells transfected with No.4, 5 and 2 full-length cDNAs was high. Conclusion No.4, 5 and 2 full-length cDNAs of IRM-2 mouse are of high radioresistance. -
Key words:
- Oligonucleotide array sequence analysis /
- Gene library /
- IRM-2 mice
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