-
桂皮酸为樟科植物肉桂的成分之一，属芳香族氨基酸，长期以来被人们用作肉类食物的调味剂[1]。有报道把它称为一种调节植物分化和生长的激素，还具有抗微生物、抗炎、抗血小板凝聚的作用[2]。从蜂胶中发现的咖啡酸乙酯，因其具有广泛的生物活性（如抗炎、抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等作用）而备受关注[3]。郭原健等[4]研究发现，桂皮酸的天然羟基衍生物阿魏酸、咖啡酸、邻香豆酸、对香豆酸具有抗突变活性。也有报道称，桂皮酸衍生物具有增强巨噬细胞吞噬活性和激活细胞免疫的作用，以及抗辐射和清除自由基的活性[5-7]。丹皮酚为中药牡丹皮（芍药科植物牡丹的根皮）和徐长卿（萝藦科植物徐长卿的全草）的主要活性成分[8]。有文献表明，天然酚类成分丹皮酚具有明显的抗自由基活性[9-10]。通过化学拼合原理，合成筛选出了对甲基桂皮酸丹皮酚酯衍生物。本研究以30 d存活率、脏器指数、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、血小板计数（platelet count，PLT）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛等为指标，考察对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠的抗辐射作用和抗氧化作用，研究其抗辐射活性。
-
将我室自行合成的纯度在98%以上（高效液相色谱分析结果）的对甲基桂皮丹皮酚酯研细后，用5‰的羧甲基纤维素钠溶液配成浓度为7.5、5.0、2.5 mg/ml（高、中、低3个浓度）的混悬液。SOD、丙二醛、考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物试剂公司。
-
ICR小鼠共110只，其中，雄性75只、雌性35只，6~8周龄，体质量20~22 g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。荧光显微镜为日本奥林巴斯公司产品，137Cs γ射线辐射源由加拿大原子能有限公司提供，KX-21N血液生化分析仪为日本Sysmex公司产品，UV-190型紫外分光光度计为日本Kyoto公司产品。
-
ICR小鼠70只，雌雄各半，按体质量随机分成5组，14只/组，分别为空白对照组（5‰羧甲基纤维素钠）、阳性对照组（茜草双酯，100 mg/kg）、对甲基桂皮丹酚酯高（150 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（50 mg/kg）3个剂量组。各组均在照射前3、2、1 d连续3次口服灌胃给药（0.1 ml/10 g体质量），137Cs γ射线8.5 Gy一次性全身照射，每天观察记录小鼠的存活情况。
-
ICR雄性小鼠40只，按体质量随机分成5组，8只/组，分别为空白对照组（5‰羧甲基纤维素钠）、阳性对照组（茜草双酯，100 mg/kg）、对甲基桂皮丹酚酯高（150 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（50 mg/kg）3个剂量组。各组均在照射前3、2、1 d连续3次口服灌胃给药（0.1 ml/10 g体质量），137Cs γ射线6.5 Gy一次性全身照射。
10%脏器组织匀浆的制备：准确称取待测组织的质量，按质量体积比加生理盐水制备成10%组织匀浆，以15 cm作为离心半径，2000 r/min，离心10 min，待用。
组织蛋白浓度的测定：取10%组织匀浆的上清，取1~2个样，用生理盐水按1:1、1:4、1:9的比例稀释进行预实验，蛋白浓度在0.1~1.3 mg/ml范围内呈线性关系，1.0 mg/ml左右最佳。选择最佳比例，用生理盐水进行稀释待测，肺为1:4，肝为1:9。蛋白浓度的测定按考马斯亮蓝试剂盒说明书进行操作。
-
照射后第8天，经眼眶取血，用血液生化分析仪检测WBC和PLT，解剖小鼠取肝脏、脾脏、胸腺，用电子天平称量质量，计算肝脏、脾脏、胸腺指数。
-
照射后第8天将小鼠脱臼处死，取一侧股骨，用白细胞稀释液冲洗骨髓，在电子显微镜下计数BMNC。取另一侧股骨，用0.05 mol/L氯化钙溶液冲洗骨髓，加入0.2 mol/L高氯酸反应液，滤液用紫外分光光度计测定吸光度。
-
取肝、肺的10%组织匀浆上清，1~2个样，用生理盐水按1:1、1:4、1:9、1:19、1:29、1:39、1:49的比例稀释进行预实验，抑制率在45%~50%为最佳稀释倍数。选择最佳比例，用生理盐水进行稀释待测，肺为1:9，肝为1:39。SOD水平的测定按SOD试剂盒说明书进行操作。
-
采用硫代巴比妥法，过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色的产物，在532 nm处有最大吸收峰。取肝、肺的10%组织匀浆上清，按丙二醛试剂盒说明书进行操作。
-
采用SPSS 12.0统计学软件，各组数据采用均数±标准差（$\bar x \pm s$）表示，组间比较采用配对t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
-
由图 1和表 1可见，对甲基桂皮丹酚酯低、中、高剂量组小鼠的30 d存活率分别为28.57%、42.86%、35.71%，与空白对照组（14.29%）比较，明显延长了小鼠的生存时间（t=1.33、2.26和1.38，P分别为 > 0.05、 < 0.05和 > 0.05），尤其是中剂量组。
图 1 对甲基桂皮丹酚酯各剂量组小鼠30 d存活率的实验结果
组别 只数 存活率（%） 平均生存时间（d） 保护指数 空白对照组 14 14.29 9.93±9.28 - 阳性对照组 14 28.57 14.64±10.49 1.48 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 14 28.57 14.86±10.30 1.50 对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 14 42.86 18.50±10.72 2.01 对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 14 35.71 15.36±11.61 1.60 注：表中，“-”表示无此项数据。 表 1 对甲基桂皮丹酚酯各剂量组小鼠经8.5 Gy γ射线照射后的30 d存活率和保护指数
-
由表 2可见，与空白对照组相比，虽然各实验组的脏器指数没有表现出统计学意义，但各实验组的多个脏器指数均有所增加。脾结节数和脾脏指数与机体的造血功能恢复相关，而胸腺指数为机体免疫功能的重要指标。实验组胸腺指数和脾脏指数的增大可以初步说明对甲基桂皮丹酚酯有增强免疫和改善造血系统功能的作用。
组别 只数 胸腺指数 脾脏指数 肝脏指数 空白对照组 8 0.837±0.65 1.158±0.22 49.62±4.57 阳性对照组 8 1.312±0.65 1.418±0.41 55.34±3.61 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 1.309±0.65
（t=1.453）1.106±0.59
（t=-0.231）52.52±4.02
（t=1.348）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 1.220±0.78
（t=1.067）1.349±0.25
（t=1.622）53.17±8.47
（t=1.406）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 1.147±0.15
（t=1.315）1.463±0.44
（t=1.373）52.91±5.49
（t=1.184）注：表中，括号内为各组与空白对照组比较所得t值，P均 > 0.05。 表 2 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠脏器指数的影响（
$\bar x \pm s$ -
由表 3可见，对甲基桂皮丹酚酯各剂量组与空白对照组比较，小鼠WBC和BMNC差异无统计学意义，而PLT显著提高，对甲基桂皮丹酚酯高剂量组DNA含量亦明显增加，该结果表明对甲基桂皮丹酚酯能够提高小鼠的造血功能。
组别 只数 WBC（×109/L） PLT（×1012/L） BMNC（×106/根股骨） DNA含量（吸光度值） 空白对照组 8 0.59±0.21 0.737±0.158 2.803±1.054 0.108±0.087 阳性对照组 8 0.70±0.31 0.823±0.336 4.045±3.313 0.444±0.311 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 0.47±0.35#
（t=-0.838）1.121±0.239**
（t=3.797）2.780±1.165#
（t=-0.041）0.201±0.204#
（t=1.188）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 0.50±0.21#
（t=-0.86）1.420±0.244**
（t=6.667）2.637±0.986#
（t=-0.326）0.290±0.278#
（t=1.767）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 0.77±0.36#
（t=1.22）1.018±0.243*
（t=2.743）3.853±2.616#
（t=1.053）0.448±0.257**
（t=3.537）表 3 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠造血系统的影响
-
由表 4可见，与空白对照组比较，各实验组小鼠的肝、肺SOD水平均有所增加，且部分具有统计学意义。SOD水平随着对甲基桂皮丹酚酯剂量的增加而增加，呈现一定的剂量相关性。与阳性对照组比较，各实验组的肝、肺SOD水平也均有所增加，尤其是高剂量组明显增加。SOD能清除超氧阴离子自由基（O2-），保护细胞免受损伤。实验组小鼠SOD水平的增加，说明对甲基桂皮丹酚酯可以减轻小鼠的辐射损伤，具有抗辐射活性。
组别 只数 肝SOD（U/mg） 肺SOD（U/mg） 空白对照组 8 383.46±67.45 87.54±11.67 阳性对照组 8 410.32±141.59 92.22±22.66 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 419.55±106.42#
（t=0.81）116.48±14.99**
（t=4.308）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 518.61±128.61*
（t=2.632）121.74±25.65**
（t=3.433）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 547.90±121.88**
（t=3.339）129.05±22.42**
（t=4.644）注：表中，SOD：超氧化物歧化酶；括号内为各组与空白对照组比较所得t值，#为P > 0.05，*为P < 0.05，**为P < 0.01。 表 4 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠肝和肺SOD的影响
-
由表 5可见，与空白对照组比较，各实验组的肝、肺丙二醛水平均有所降低，尤其是高剂量组，比阳性对照组还有所减小。实验组小鼠丙二醛水平的降低，说明对甲基桂皮丹酚酯可以抵抗由辐射造成的机体脂质过氧化，从而减轻细胞毒性，因此具有抗辐射活性，且中、高剂量组的效果较佳。
组别 只数 肝丙二醛（nmol/mg） 肺丙二醛（nmol/mg） 空白对照组 8 2.61±0.34 2.59±0.32 阳性对照组 8 2.13±0.39 2.72±0.49 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 2.36±0.66#
（t=-0.948）2.43±0.65#
（t=-0.557）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 1.80±0.51**
（t=-3.541）2.38±0.65#
（t=-0.73）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 1.50±0.27**
（t=-7.218）1.91±0.22**
（t=-3.581）注：表中，括号内为各组与空白对照组比较所得t值，#为P > 0.05，*为P < 0.05，**为P < 0.01。 表 5 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠肝和肺丙二醛的影响
-
辐射损伤可引起机体中氧自由基和氮自由基浓度的大幅增高，自由基可引发脂质过氧化作用而产生丙二醛，具有较强的细胞毒性[11]。抗氧化剂通过清除自由基抑制一系列生物大分子（如DNA）的氧化反应，从而起到对细胞的保护作用。本研究通过对ICR小鼠行γ射线一次性全身照射，以30 d存活率、脏器指数、WBC、PLT、DNA以及丙二醛、SOD等为指标研究目标化合物对甲基桂皮丹酚酯的抗辐射损伤活性及其抗辐射损伤和抗氧化活性之间的关系。实验结果显示，与空白对照组相比，对甲基桂皮丹酚酯能提高辐射损伤小鼠的30 d存活率，并在一定程度上具有增强免疫和改善造血系统的作用。对甲基桂皮丹酚酯还可以增加肝、肺组织中SOD的含量，同时减少肝、肺组织中的丙二醛含量，说明其具有一定的抗氧化作用。由此可见，对甲基桂皮丹酚酯的抗辐射损伤作用可能与其抗氧化作用具有一定的相关性。
对甲基桂皮丹酚酯抗辐射活性的研究
Protective effect of P-methyl cinnamic paeonol esters against radiation damage
-
摘要:
目的 研究对甲基桂皮丹酚酯的抗辐射活性。 方法 以6~8周龄的ICR小鼠作为研究对象，经137Cs γ射线一次性全身照射后，以30 d存活率、血液生化指标、脏器指数及肺和肝的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛为指标，考察低、中、高3个剂量组的对甲基桂皮丹酚酯的抗辐射损伤效应。 结果 对甲基桂皮丹酚酯可以提高经8.5 Gy 137Cs γ射线一次性全身照射损伤ICR小鼠的30 d存活率，对小鼠经6.5 Gy 137Cs γ射线一次性全身照射损伤生理指标影响的检测结果显示，对甲基桂皮丹酚酯在不同程度上提高了血小板和DNA含量、胸腺指数和脾脏指数；且SOD水平随着对甲基桂皮丹酚酯剂量的增加而增加，而丙二醛水平则有所降低，尤其是高剂量组的效果较显著。 结论 对甲基桂皮丹酚酯可能具有抗辐射损伤作用。 Abstract:Objective To study the radiaition protective effect of P-methyl cinnamic paeonol esters on irradiated mice. Methods ICR mice of age 6-8 weeks were selected as investigated subjects, then the mice whole body were irradiated with 6.5 Gy or 8.5 Gy137Cs γ-ray. The 30-day survival rates, organ indexes, superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde levels in lung and liver were observed to evaluate the radiation protective effect of P-methyl cinnamic paeonol esters in high, medium, low dose groups. Results P-methyl cinnamic paeonol esters increased the 30-day survival rates of 8.5 Gy whole body irradiated mice. And after 6.5 Gy whole body irradiation, P-methyl cinnamic paeonol esters could enhance the platelet counts, DNA levels and thymus, spleen index. Meanwhile, SOD levels were increased with the increasing dose of P-methyl cinnamic paeonol esters, while malondialdehyde levels were decreased, especially in the high dose group. Conclusion P-methyl cinnamic paeonol esters may play an important role in radiation resistance. -
表 1 对甲基桂皮丹酚酯各剂量组小鼠经8.5 Gy γ射线照射后的30 d存活率和保护指数
组别 只数 存活率（%） 平均生存时间（d） 保护指数 空白对照组 14 14.29 9.93±9.28 - 阳性对照组 14 28.57 14.64±10.49 1.48 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 14 28.57 14.86±10.30 1.50 对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 14 42.86 18.50±10.72 2.01 对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 14 35.71 15.36±11.61 1.60 注：表中，“-”表示无此项数据。 
下载: 导出CSV
表 2 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠脏器指数的影响（
$\bar x \pm s$ 组别 只数 胸腺指数 脾脏指数 肝脏指数 空白对照组 8 0.837±0.65 1.158±0.22 49.62±4.57 阳性对照组 8 1.312±0.65 1.418±0.41 55.34±3.61 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 1.309±0.65
（t=1.453）1.106±0.59
（t=-0.231）52.52±4.02
（t=1.348）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 1.220±0.78
（t=1.067）1.349±0.25
（t=1.622）53.17±8.47
（t=1.406）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 1.147±0.15
（t=1.315）1.463±0.44
（t=1.373）52.91±5.49
（t=1.184）注：表中，括号内为各组与空白对照组比较所得t值，P均 > 0.05。
下载: 导出CSV
表 3 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠造血系统的影响
组别 只数 WBC（×109/L） PLT（×1012/L） BMNC（×106/根股骨） DNA含量（吸光度值） 空白对照组 8 0.59±0.21 0.737±0.158 2.803±1.054 0.108±0.087 阳性对照组 8 0.70±0.31 0.823±0.336 4.045±3.313 0.444±0.311 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 0.47±0.35#
（t=-0.838）1.121±0.239**
（t=3.797）2.780±1.165#
（t=-0.041）0.201±0.204#
（t=1.188）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 0.50±0.21#
（t=-0.86）1.420±0.244**
（t=6.667）2.637±0.986#
（t=-0.326）0.290±0.278#
（t=1.767）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 0.77±0.36#
（t=1.22）1.018±0.243*
（t=2.743）3.853±2.616#
（t=1.053）0.448±0.257**
（t=3.537）
下载: 导出CSV
表 4 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠肝和肺SOD的影响
组别 只数 肝SOD（U/mg） 肺SOD（U/mg） 空白对照组 8 383.46±67.45 87.54±11.67 阳性对照组 8 410.32±141.59 92.22±22.66 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 419.55±106.42#
（t=0.81）116.48±14.99**
（t=4.308）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 518.61±128.61*
（t=2.632）121.74±25.65**
（t=3.433）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 547.90±121.88**
（t=3.339）129.05±22.42**
（t=4.644）注：表中，SOD：超氧化物歧化酶；括号内为各组与空白对照组比较所得t值，#为P > 0.05，*为P < 0.05，**为P < 0.01。
下载: 导出CSV
表 5 对甲基桂皮丹酚酯对辐射损伤小鼠肝和肺丙二醛的影响
组别 只数 肝丙二醛（nmol/mg） 肺丙二醛（nmol/mg） 空白对照组 8 2.61±0.34 2.59±0.32 阳性对照组 8 2.13±0.39 2.72±0.49 对甲基桂皮丹酚酯低剂量组 8 2.36±0.66#
（t=-0.948）2.43±0.65#
（t=-0.557）对甲基桂皮丹酚酯中剂量组 8 1.80±0.51**
（t=-3.541）2.38±0.65#
（t=-0.73）对甲基桂皮丹酚酯高剂量组 8 1.50±0.27**
（t=-7.218）1.91±0.22**
（t=-3.581）注：表中，括号内为各组与空白对照组比较所得t值，#为P > 0.05，*为P < 0.05，**为P < 0.01。
下载: 导出CSV
-
[1] 张克俭, 曾宪昌, 刘兵城, 等.桂皮酸诱导NB4细胞凋亡.武汉大学学报:医学版, 2003, 24(4):327-331.
[2] 张迎红.桂皮酸及其衍生物与肿瘤.肿瘤研究与临床, 2001, 13(5):353-355. doi: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2001.05.035
[3] Mishima S, Ono Y, Araki Y, et al. Two related cinnamic acid derivatives from Brazilian honey bee propolis, baccharin and drupanin, induce growth inhibition in allografted sarcoma S-180 in mice. Biol Pharm Bull, 2005, 28(6):1025-1030. doi: 10.1248/bpb.28.1025 [4] 郭原健, 凌宝银, 傅娟玲, 等.羟桂皮酸衍生物的抗突变作用.卫生毒理学杂志, 1993, 7(3):175-177.
[5] 董欣, 宋金芳, 章琦, 等.肉桂酸硫酯衍生物的合成及其辐射防护作用研究.辐射研究与辐射工艺学报, 1997, 15(2):105-108.
[6] 张立伟, 赵春贵, 杨频.肉桂酸衍生物清除羟基自由基活性研究.中国医院药学杂志, 2004, 24(11):662-663. doi: 10.3321/j.issn:1001-5213.2004.11.003
[7] Choo WS, Birch EJ. Radical scavenging activity of lipophilized products from lipase-catalyzed transesterification of triolein with cinnamic and ferulic acids. Lipids, 2009, 44(2):145-152. doi: 10.1007/s11745-008-3242-x [8] 章灵华, 肖培根, 黄艺, 等.丹皮酚的药理与临床研究进展.中国中西医结合杂志, 1996, 16(3):187-190. doi: 10.3321/j.issn:1003-5370.1996.03.020
[9] Upasani CD, Balaraman R. Protective effect of spirulina on lead induced deleterious changes in the lipid peroxidation and endogenous antioxidants in rats. Phytother Res, 2003, 17(4):330-334. [10] Chen B, Ning M, Yang G. Effect of paeonol on antioxidant and immune regulatory activity in hepatocellular carcinoma rats. Mole-cules, 2012, 17(4):4672-4683. [11] Lee JH, Choi IY, Kil Is, et al. Protective role of superoxide dismu-tases against ionizing radiation in yeast. Biochim Biophys Acta, 2001, 1526(2):191-198. -
点击查看大图
图(1)表(5)
计量
- 文章访问数: 2213
- HTML全文浏览量: 934
- PDF下载量: 5