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Rho即Ras相似物鸟苷三磷酸酶（Ras homologue guanosine triphosphatases，GTPase），是小GTPase家族（small GTPase family）中的一个亚家族。Rho蛋白亚家族在人类中已发现至少有25个成员，RhoA、Rac1和Cdc42是其中被研究得最多的3个小G蛋白[1]。Rho在细胞中参与调控很多生物学过程，包括细胞骨架组装、细胞运动、基因表达、细胞周期、细胞增殖和存活等。在参与细胞生理活动过程中，Rho分子呈现两种相互转换的形式：与鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）结合的非活化态以及与GTP结合的活化态。上游信号刺激使GDP从非活化态Rho蛋白中解离下来，并使Rho蛋白结合上GTP成为活化态，这一分子过程由鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）催化完成[2]。多数GEFs都在细胞质中发挥作用，但是RhoA的特异性GEF——神经上皮细胞转化基因1（neuroepithelioma transforming gene 1，Net1）却位于细胞核中[3]。既往研究表明，电离辐射会激活RhoA，从而促进肌动蛋白应力纤维的形成及细胞存活[4]。最新研究发现，正是位于细胞核中的Net1受到电离辐射刺激后激活RhoA[5]。但是关于Net1在电离辐射损伤反应中的生物学功能尚不清楚。因而本研究采用RNA干扰技术特异性沉默Net1，进一步探讨Net1表达对细胞的电离辐射损伤反应的影响。
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人宫颈癌HeLa细胞和人胚肾上皮细胞（293T细胞）由本实验室保存，用含10%胎牛血清（购自美国Gibco公司）的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2的条件下培养。携带Net1短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）片段的慢病毒载体及病毒包装质粒均购自美国Sigma公司。RNeasy Mini试剂盒及QuantiTect反转录试剂盒均购自德国Qiagen公司。SYBR Green预混合物购自瑞士Roche公司。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗体、毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）抗体、磷酸化ATM抗体、细胞周期检验点激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）抗体、磷酸化Chk2抗体、p38抗体和磷酸化p38抗体均购自美国Cell Signaling Technology；微管蛋白（tubulin）抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphote dehydrogenase，GAPDH）抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司。细胞γ射线照射采用137Cs源（由加拿大原子能有限公司提供），剂量率为5 Gy/min。
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将携带Net1 shRNA或者shRNA对照片段的慢病毒载体与慢病毒包装质粒一同转染到293T细胞中。转染后48 h和72 h，两次收集细胞上清液，其中包含有成熟的慢病毒，并使用0.45 mm滤膜去除上清液中残留的细胞碎片，保存于-80 ℃冰箱中。
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病毒转染前1 d将细胞种植于6孔细胞培养板中。第2天，移弃孔中的培养基，换成1 ml新鲜培养基（含有终浓度为8 μg/ml的Polybrene），再加入1 ml含慢病毒的培养液，在细胞培养箱中孵育6 h后，更换成常规的新鲜培养基继续培养2~3 d，然后用嘌呤霉素（puromycin）筛选4~6 d。
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收集细胞，并用RNeasy Mini试剂盒提取细胞中的总RNA，然后用QuantiTect反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA。使用SYBR Green预混合物，按说明书要求添加引物和模板，每个PCR反应的总体积为20 μl。qPCR反应程序：95 ℃ 10 min激活DNA聚合酶；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；熔解曲线程序为机器默认设置。qPCR反应中所用引物如下：
Net1引物：
5’- GCTGACTCGGTGTGGATTGAT-TGG -3’
5’- CGAAGGGTAAATGACTGTATT-GTTTGACC -3’
Net1A引物：
5’- GCAGAGAGAAAGATGATGA-TGTTG -3’
5’- TAAATCCTGTTCACCTCGGG-AC -3’
GAPDH引物：
5’- GGAAGGTGAAGGTCGGA-GTC -3’
5’-GCTCCTGGAAGATGGTGA-TG -3’
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对稳定转染Net1 shRNA或者shRNA的HeLa细胞进行2 Gy或4 Gy的γ射线照射，照射后的细胞根据不同的照射剂量接种不同数量的细胞到60 mm直径培养皿中，每个剂量点设置2个接种浓度，每个浓度接种3个培养皿。等到集落形成之后，移去培养基，用含0.25%结晶紫的乙醇固定细胞并给细胞染色，流水洗净，计数大于50个细胞的集落数。实验重复3次。
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裂解细胞，提取总蛋白，测定总蛋白浓度。取40 μg总蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转移法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，于4 ℃一抗孵育过夜，室温二抗孵育1 h，加显色剂显色曝光。
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采用SPSS13.0软件进行独立样本t检验，数据以均数±标准差（$\bar x \pm s$）表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。
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细胞中的Net1蛋白存在两种同源异构体：Net1蛋白和Net1A蛋白，即它们由同一基因编码，但Net1A蛋白产物比Net1蛋白产物缺少N端的145个氨基酸。由于我们所使用的Net1 shRNA的靶序列位于两个同源异构体的共同区域内，为了区分这两种相似的同源异构体的敲低效果，我们设计了特异性的PCR引物来分别检测这两种同源异构体的相对mRNA水平。由图 1a可见，在被慢病毒介导的Net1 shRNA转染的HeLa细胞中，Net1和Net1A的相对mRNA水平都显著下降（Net1：t=19.88，P < 0.01；Net1A：t=3.131，P < 0.05），表明Net1 shRNA能有效地沉默Net1基因。集落存活实验统计结果见图 1b，在2 Gy照射下，敲低Net1细胞的集落形成率为24.2%，与对照组细胞的集落形成率（37.3%）相比明显下降，两者间差异具有统计学意义（t=3.816，P < 0.05）；在4 Gy照射下，对照组细胞集落形成率为15.3%，与之相比，敲低Net1细胞的集落形成率（3.4%）下降更明显（t=12.49，P < 0.01），表明当细胞中缺少Net1时其对电离辐射的敏感性增加。
图 1 沉默Net1增加细胞对电离辐射的敏感性
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受到γ射线照射的Net1缺失细胞的集落形成率显著降低，是否由于加大辐射剂量后细胞凋亡程度所致？为了回答这个问题，我们在细胞接受γ射线照射后的不同时间点取样，采用免疫印迹法检测PARP水平，因为PARP的蛋白酶解是细胞凋亡的一个早期分子标志。在细胞凋亡启动时，相对分子质量为116×103的PARP在Asp216-Gly217之间被caspase-3剪切成85 ×103和31 ×103两个片段。如图 2所示，在对照组细胞中，从照射后24 h才开始出现PARP裂解产物（85 ×103）；而在抑制Net1表达的细胞中，85 ×103的裂解产物在照射后2 h就出现，并且裂解产物的水平比相对应的对照细胞中的水平明显增加，表明当细胞中缺少Net1时，电离辐射会导致更多的细胞进行程序性死亡。
图 2 抑制Net1表达促进电离辐射后的细胞凋亡
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电离辐射对细胞造成的最直接损伤是引起DNA损伤，并以DNA双链断裂为主。细胞为了维持基因组的稳定性，在长期进化过程中形成了DNA损伤应激系统，由许多蛋白激酶、损伤效应分子及修复蛋白组成不同的信号通路。其中，ATM-Chk2信号通路是应对DNA双链断裂最常见的一条通路，而且这些蛋白激酶特异位点磷酸化的强度可以反映它们的活性程度，因此我们首先使用免疫印迹法检测了ATM和Chk2的激活情况。由图 3可见，γ射线照射后，在Net1受到抑制的细胞中磷酸化ATM与磷酸化Chk2的水平都比对照组细胞增多，并且照射后出现的时间也比在对照组中提前，表明ATM和Chk2在缺少Net1的情况下更易被激活。另外，p38丝裂原活化蛋白激酶途径也是一条重要的DNA双链断裂应激通路，所以我们也检测了电离辐射激活p38的情况，发现Net1是否存在对p38的磷酸化没有明显影响，表明Net1可能不影响p38应激通路。
图 3 抑制Net1刺激ATM-Chk2信号通路
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由于Rho蛋白和GEFs在细胞中主要定位于细胞质中或质膜上，以往认为在细胞核中GEFs是没有活性的，如Net1，它只有转移到细胞质中才能激活Rho蛋白。然而，最近Dubash等[5]研究发现，Net1在细胞核中具有活性，当细胞受到电离辐射刺激后，Net1能在细胞核中直接激活RhoA。因此，Net1很可能是电离辐射损伤反应中RhoA通路中的损伤感应分子。研究Net1的生物学功能，将为电离辐射损伤分子机制的研究开辟新的领域，并将为在医学领域开发和利用Net1和RhoA提供基础理论依据。
本实验旨在研究Net1在电离辐射反应中的生物学功能。通过慢病毒介导的Net1 shRNA稳定降低HeLa细胞中Net1和Net1A的表达，使得细胞对电离辐射的敏感性显著增强，而且辐射后大量细胞提早进入细胞凋亡程序，甚至少量未受到照射的细胞也走向凋亡，表明Net1和（或）Net1A在DNA损伤修复中发挥着重要作用，提示Net1对于受照射的细胞具有一定的辐射保护作用。但是，由于所使用的Net1 shRNA不能区分Net1和Net1A这两个同源异构体，所以到底是Net1起作用，或是Net1A起作用，还是两者的共同作用，还有待今后的进一步研究。
此外，本研究还探讨了在辐射损伤反应中可能与Net1相关的信号通路。电离辐射导致DNA双链断裂，该DNA损伤信号通常会磷酸化ATM和Chk2使其转变为活性状态，从而激活下游一系列DNA损伤修复中的效应分子，因此，ATM-Chk2信号通路是电离辐射损伤反应中一条至关重要的信号转导通路[6]。我们发现，在细胞缺失Net1时，电离辐射导致ATM和Chk2提前激活并且活性程度比对照组细胞强，而且ATM和Chk2被激活的时间也比对照组细胞长，提示Net1缺陷细胞中DNA修复能力可能降低，以致于无法被修复的DNA损伤累积，导致更多的ATM和Chk2被激活。另一方面，有文献报道，在ATM缺陷细胞中，DNA损伤对RhoA的激活被抑制[7]，提示Net1-RhoA损伤反应通路可能位于ATM激酶的下游。Net1-RhoA通路与ATM-Chk2信号通路之间的相互关系还需要进一步研究。
综上所述，本研究结果显示，Net1在电离辐射损伤反应中具有保护细胞的重要生物学功能，提示Net1在辐射损伤修复中具有重要作用，具体的机制需进一步深入研究。
shRNA干扰沉默Net1基因对电离辐射损伤反应的影响
The effects of short hairpin RNA-mediated silencing Net1 on ionizing radiation-induced damage responses
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摘要:
目的 研究神经上皮细胞转化基因1（NET1）在电离辐射损伤反应中的生物学功能。 方法 运用RNA干扰技术，在细胞中特异性沉默Net1基因，然后通过集落存活实验和免疫印迹法研究抑制Net1表达对细胞的电离辐射损伤反应的影响。 结果 Net1敲低表达的细胞对电离辐射的敏感性增强，表现为更多细胞发生了凋亡，并且在γ射线照射后，毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ATM）和细胞周期检查点激酶2（Chk2）的磷酸化水平也比对照细胞增强。 结论 Net1对于受到电离辐射的细胞有一定的保护作用，很可能在电离辐射损伤修复中具有重要作用。 -
关键词:
- 电离辐射 /
- RNA干扰 /
- 细胞凋亡 /
- 神经上皮细胞转化基因1
Abstract:Objective To study the biological roles of the neuroepithelioma transforming gene 1 (Net1)in the cellular responses to ionizing radiation(IR)-induced damage. Methods Specific shRNA was used to deplete Net1 in cells. The effects of Net1 depletion on the cellular responses to ionizing radiation were investigated through the colonogenic survival assay and immunoblotting analysis of DNA damage response proteins′ phosphorylation. Results Net1-depleted cells were more sensitive to IR, with a significantly increased induction of apoptosis. In response to IR, the phosphorylation levels of ataxia-telangiectasia mutated and checkpoint kinase 2 were much higher in the Net1-depleted cells than that in the control cells. Conclusion Net1 protects IR-treated cells from apoptosis and possibly plays an important role in IR-induced damage response and repair. -
Key words:
- Ionizing radiation /
- RNA interference /
- Apoptosis /
- Neuroepithelioma transforming gene
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[1] Wennerberg K, Der CJ. Rho-family GTPases:it's not only Rac and Rho(and I like it). J Cell Sci, 2004, 117(Pt 8):1301-1312. [2] Rossman KL, Der CJ, Sondek J. GEF means go:turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6(2):167-180. [3] Schmidt A, Hall A. The Rho exchange factor Net1 is regulated by nuclear sequestration. J Biol Chem, 2002, 277(17):14581-14588. doi: 10.1074/jbc.M111108200 [4] Guerra L, Carr HS, Richter-Dahlfors A, et al. A bacterial cytotoxin identifies the RhoA exchange factor Net1 as a key effector in the response to DNA damage. PLoS One, 2008, 3(5):e2254. doi: 10.1371/journal.pone.0002254 [5] Dubash AD, Guilluy C, Srougi MC, et al. The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals. PLoS One, 2011, 6(2):e17380. doi: 10.1371/journal.pone.0017380 [6] Matsuoka S, Rotman G, Ogawa A, et al. Ataxia telangiectasia-mutated phosphorylates Chk2 in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(19):10389-10394. doi: 10.1073/pnas.190030497 [7] Frisan T, Cortes-Bratti X, Chaves-Olarte E, et al. The Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin induces DNA double-strand breaks and promotes ATM-dependent activation of RhoA. Cell Microbiol, 2003, 5(10):695-707. doi: 10.1046/j.1462-5822.2003.00311.x -
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图(3)
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