Graves病组:Graves病患者共90例, 其中, 男性33例、女性57例。纳入标准:选取经我院门诊确诊为Graves病初发或复发未经治疗的患者, 年龄为17~49岁, 诊断依据为人民卫生出版社第7版《内科学》关于Graves病的诊断标准^[4]。排除标准:凡伴急慢性感染、肿瘤、器官移植术后、严重器质性疾病及妊娠且无其他自身免疫性疾病及家族史者均予排除。

正常对照组:选取我院健康体检者50名, 其中, 男性22名、女性28名, 年龄17~49岁。体检者需各项常规检查指标正常, 无甲状腺疾病和其他自身免疫性疾病及家族史, 无肿瘤、器官移植术后、严重器质性疾病及妊娠。

两组受检者的性别、年龄差异无统计学意义。

多甲藻叶绿素蛋白荧光标记的CD4⁺抗体, 异硫氰酸荧光标记的鼠抗人免疫球蛋白G1, 藻红蛋白荧光标记的大鼠免疫球蛋白G1, 异硫氰酸荧光标记的CD25⁺抗体, 藻红蛋白荧光标记的鼠抗人CD127抗体, 红细胞裂解液, 鞘液, FACSCalibur型流式细胞仪均购自美国Becton Dickinson公司; 促甲状腺激素受体抗体(thyrotropin receptor antibody, TRAb)由天津市协和医药科技有限公司生产; XH-6020型γ免疫计数器由西安核仪器厂(国营二六二厂)生产。

外周血CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg检测:用乙二胺四乙酸抗凝管抽取3 ml外周静脉血, 取50 μl全血加入多甲藻叶绿素蛋白荧光标记的CD4⁺抗体5 μl、异硫氰酸荧光标记的鼠抗人免疫球蛋白G1抗体2.5 μl、藻红蛋白荧光标记的大鼠免疫球蛋白G1抗体2.5 μl作为对照管; 另取50 μl全血加入多甲藻叶绿素蛋白荧光标记的CD4⁺抗体5 μl、异硫氰酸荧光标记的CD25⁺抗体2.5 μl、藻红蛋白荧光标记的鼠抗人CD127抗体2.5 μl作为测量管; 两管分别常温避光孵育15~20 min, 加入红细胞裂解液1 ml, 避光放置5 min后, 以20 cm为离心半径, 1500 r/min离心6 min, 弃上清液并加入鞘液2 ml, 洗涤、混匀, 以20 cm为离心半径, 1500 r/min离心6 min后弃上清液, 再次加入鞘液500 μl。用流式细胞仪Treg模板检测其表达情况。

采用化学发光法测定外周血中总三碘甲状腺原氨酸(total triiodothyronine, TT₃)、总甲状腺素(total thyroxine, TT₄)、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine, FT₃)、游离甲状腺素(free thyroxine, FT₄)的水平; 采用放射免疫分析法检测外周血中促甲状腺激素受体抗体(thyrotropin receptor antibody, TRAb)、甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody, TGAb)、甲状腺微粒体抗体(thyroid microsomal antibody, TMAb)的水平。

使用SPSS13.0软件进行统计学分析。连续变量数据用x±s表示, 采用独立样本t检验进行组间差异比较, 对非正态分布数据采用对数转换为正态分布后进行分析。TRAb水平为开放性数据, 且分布偏倚, 故未进行均数比较。将CD4⁺CD25⁺CD127^-Treg与TRAb、非正态分布数据进行Spearman等级相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

Graves病组外周血中TT₃、TT₄、FT₃、FT₄、TGAb、TMAb水平均高于正常对照组, 外周血中CD4⁺CD25⁺CD127^-Treg数量较正常对照组明显降低[(1.39%±1.09%)vs.(4.59%±1.14%)], 差异有统计学意义(t=16.4, P＜0.01) (表 1)。

Graves病组CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg数量与TRAb水平呈负相关(r＝-0.24, P＜0.05), 与TT₃、TT₄、FT₃、FT₄、TGAB、TMAB水平呈负相关(r＝-0.62、-0.65、-0.56、-0.71、-0.50、-0.15, P均＜0.01), 与年龄无相关性(r＝-0.15, P＞0.05)。

正常机体对自身抗原的免疫耐受是一个极其复杂且严密的调控过程。上世纪90年代中期, 一种自然发生的免疫调节性细胞CD4⁺CD25⁺Treg被发现, 并且被认为可能对维持机体的中枢和外周免疫耐受起到重要作用, 这使得这一领域的研究取得了重要进展^[1]。

目前的观点普遍认为, CD4⁺CD25⁺Treg具有免疫无能性和免疫抑制性两大特性^[5-6], 对CD4⁺CD25^-T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和单核细胞等多种免疫细胞均有抑制作用, 可以防止自身免疫现象的发生; CD4⁺CD25⁺Treg约占外周CD4⁺T细胞总数的5%~10%^[7], CD4⁺CD25⁺Treg功能减低或数量减少可导致或加重自身抗原的高水平免疫应答。在对Graves病模型大鼠的研究中发现, Graves病的发生及严重程度都与CD4⁺CD25⁺Treg的数量有关^[8], 证实了Treg在大鼠Graves病发病中的作用。

但对人类CD4⁺CD25⁺Treg与Graves病关系的研究结论却并不一致, 党珊和施秉银^[9]研究发现, Graves病患者与正常人外周血CD4⁺CD25⁺Treg数量的差异有统计学意义, 但差异不是很明显; 而李惠芝等^[2]和高书涛等^[3]的研究却显示, Graves病患者与正常人外周血CD4⁺CD25⁺Treg数量的差异无统计学意义。

目前研究和利用人CD4⁺CD25⁺Treg的最大障碍是缺乏理想的特异性标志物。人CD4⁺CD25⁺Treg最基本的分子表达特征为持续、稳定表达CD25, 因此, CD25曾被认为是识别效应性和调节性CD4⁺T细胞亚型的主要标志物, 然而感染免疫后被活化的效应性CD4⁺T细胞也能表达弱至中等强度的CD25(CD4⁺CD25^low), 因此不能认为CD25是CD4⁺CD25⁺Treg的特异性标志物。后来有研究发现高表达CD25的CD4⁺T细胞(CD4⁺CD25^high)能更集中地代表人CD4⁺CD25⁺Treg^[7], 但不包含与活化的T细胞重合的那一部分CD4⁺CD25⁺Treg, 因此, CD4⁺CD25^high Treg不能完全涵盖人体内的Treg, 故也不能作为人CD4⁺CD25⁺Treg的理想标志物。2006年, Seddiki等^[10]发现, CD127可以帮助识别CD4⁺CD25⁺Treg与活化的T细胞, CD4⁺T细胞活化后高表达CD127(CD4⁺CD25⁺CD127high), 而真正的Treg仅表达较低的CD127(CD4⁺CD25⁺CD127^low)。因此, 在CD4⁺CD25⁺的基础上联合CD127可以更好地识别人CD4⁺CD25⁺Treg。

本研究采用CD4⁺CD25⁺CD127^low(即CD4⁺CD25⁺CD127^-)为标志物测定Graves病患者与正常人外周血中Treg数量, 结果显示Graves病患者CD4⁺CD25⁺CD127^-Treg在CD4⁺T细胞中所占百分比明显低于正常人, 两组间差异有统计学意义。正常人CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg在CD4⁺T细胞中占3.45%~5.73%, 此结果与相关研究结果相似^[11]。这些结果提示, CD4⁺CD25⁺CD127^-可能是CD4⁺T细胞中Treg的特异性标志物。相关性研究结果显示, CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg数量与TT₃、TT₄、FT₃、FT₄及TRAb、TMAb、TGAb水平呈负相关, 显示CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg与Graves病关系密切, 证实了动物实验中CD4⁺CD25⁺改变对Graves病发病影响的结论, 为进一步进行CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg分离及治疗Graves病提供了新的思路。

综上所述, Graves病患者CD4⁺CD25⁺CD127^-Treg数量明显低于正常人, 且与甲状腺功能指标及甲状腺自身抗体水平密切相关, 提示CD4⁺CD25⁺CD127^- Treg数量减少可能与Graves病的发病有关。CD4⁺CD25⁺CD127^-可能是人CD4⁺T细胞中Treg的特异性标志物。