IRM-2小鼠全长cDNA编码蛋白质分析

王芹 ,  刘晓秋 ,  李进 ,  杜利清 ,  孙志娟 ,  王彦 ,  刘强 ,  宋力 ,  樊飞跃

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IRM-2小鼠全长cDNA编码蛋白质分析

  • 300192 天津，北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室

    • 通讯作者: 樊飞跃, faithyfan@yahoo.com
  • 基金项目:

    中国医学科学院放射医学研究所学科发展基金 SF0822

    国家自然科学基金 30870583

Analysis of proteins encoded by full-length cDNA sequence from IRM-2 mouse

  • Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China

    • Corresponding author: Fei-yue FAN, faithyfan@yahoo.com

  • 摘要: 目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因。 方法 以IRM-2小鼠的21条表达序列标签为模板进行PCR扩增，从IRM-2小鼠全长cDNA文库中测定cDNA克隆的序列，通过与GenBank进行同源序列信息比对，对全长cDNA编码的蛋白质进行分析。 结果 从IRM-2小鼠全长cDNA文库中获得5条全长cDNA序列，与小鼠已知基因不同源，得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的理化性质等信息。 结论 通过对全长cDNA编码的蛋白质进行分析，提示IRM-2小鼠体内可能存在目前尚未发现的辐射抗性相关基因。
    Abstract: Objective To screen and isolate radioresistance-related genes from IRM-2 mouse. Methods Full-length cDNA products were amplified by PCR from IRM-2 mouse cDNA library according to twenty-one pieces of expressed sequence tags. The property of proteins encoded by full-length cDNA were analyzed by comparing with GenBank database. Results Five pieces of full-length cDNA which were not the same source as the known mice genes were found out from IRM-2 mouse cDNA library. Amino acid sequence and property of proteins encoded by these five pieces of full-length cDNA were obtained. Conclusion Proteins encoded by full-length cDNA imply that unkown radioresistance-related genes may exist in IRM-2 mouse.

  • 表 1  IRM-2小鼠5条全长cDNA编码蛋白质的理化性质

    编号 氨基酸残基数(个） 相对分子质量 氨基酸平均相对分子质量 等电点 电荷数(pH = 7.0)
    1 88 9 497 107.9 4.99 -2.0
    2 277 29 891 107.9 8.11 4.0
    3 55 6 169 112.2 4.41 -2.0
    4 491 55 536 113.1 6.73 1.5
    5 425 46 646 109.7 6.87 1.5
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    表 2  IRM-2小鼠5条全长cDNA的隶属家族

    编号 隶属家族
    1 此家族成员含有一个能部分结合到磷脂双分子层的螺旋结构，它与磷脂双分子层表面相互作用，通过结合自由的连接域参与凋亡的启动
    2 此蛋白酶体是一种新型的细胞内复合物，具有15个蛋白水解作用的亚单位。这些亚单位的同类物位于主要组织相容性复合物的两个转运蛋白之间，通过水解细胞内抗原参与抗原递呈
    3 Zepfan数据库里未查到
    4 Zepfan数据库里未查到
    5 属于围脂滴蛋白家族成员，此家族包括脂滴相关蛋白和脂肪分化相关蛋白
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出版历程
  • 收稿日期:  2012-03-28
  • 刊出日期:  2012-05-25

IRM-2小鼠全长cDNA编码蛋白质分析

    通讯作者: 樊飞跃, faithyfan@yahoo.com
  • 300192 天津，北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室
  • 收稿日期: 2012-03-28
  • 网络出版日期: 2012-05-25
基金项目:  中国医学科学院放射医学研究所学科发展基金 SF0822国家自然科学基金 30870583

摘要:  目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因。 方法 以IRM-2小鼠的21条表达序列标签为模板进行PCR扩增，从IRM-2小鼠全长cDNA文库中测定cDNA克隆的序列，通过与GenBank进行同源序列信息比对，对全长cDNA编码的蛋白质进行分析。 结果 从IRM-2小鼠全长cDNA文库中获得5条全长cDNA序列，与小鼠已知基因不同源，得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的理化性质等信息。 结论 通过对全长cDNA编码的蛋白质进行分析，提示IRM-2小鼠体内可能存在目前尚未发现的辐射抗性相关基因。

English Abstract

    全文HTML

  • IRM-2小鼠是我所培育的近交系小鼠品系，其突出的生物学特性是具有较强的辐射抗性[1]。根据mRNA差异显示分析获得的21条表达序列标签（expressed sequence tags，EST）与已知小鼠基因非同源[2]，本研究利用IRM-2小鼠全长cDNA文库[3]测定cDNA克隆的序列，通过与GenBank进行同源序列信息比对，分析全长cDNA编码蛋白质的性质，为从分子水平上揭示IRM-2小鼠抗辐射特性的本质奠定基础。

    • 1.   材料与方法

      1.1.   材料

    • IRM-2小鼠全长cDNA文库[3]由我所构建并保存。质粒小量提取试剂盒和琼脂糖购自美国Promega公司，pDNR-lib载体和pGM-T载体购自美国Invitrogen公司，21对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，大肠杆菌DH5α购自北京天根公司，氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷购自美国Roche公司。主要仪器包括美国Thermo公司生产的PCR仪，美国Bio-Rad公司生产的Gel Doc 1000凝胶成像仪。

      • 1.2.   方法

      1.2.1.   引物设计及PCR扩增

    • 从已构建好的IRM-2小鼠全长cDNA文库混合甘油菌中抽提质粒，根据已知的21条EST部分序列设计21对引物。以文库质粒pDNR-lib为模板，分别与pDNR-lib载体上多克隆位点两侧的通用引物M13+和M13-配对进行PCR扩增全长。PCR扩增的条件为94 ℃变性30 s，40 ℃退火2 min，72 ℃延伸30 s，共30个循环。

      • 1.2.2.   文库中cDNA克隆的序列测定

    • 切胶回收PCR产物中长度为500~1000 bp的片段，纯化PCR产物，将PCR产物连接入pGM-T载体，并转化感受态大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷筛选，挑取阳性克隆进行培养并抽提质粒，使用pGM-T载体通用引物T7、SP6进行序列测定。

      • 1.2.3.   文库中cDNA克隆的序列分析

    • 使用Phred软件去除低质量序列和屏蔽载体序列，使用Phrab软件进行序列拼接，导出拼接序列。将拼接序列放入GenBank数据库中进行比对，寻找同源序列信息。对获得的全长cDNA克隆进行序列分析，预测可能编码蛋白质的氨基酸序列及结构，在Zepfan数据库中寻找cDNA的隶属家族。

    2.   结果

      2.1.   全长cDNA编码蛋白质的序列

    • 根据已知的21条EST序列，以文库质粒pDNR-lib为模板进行PCR扩增全长，通过PCR产物的拼接，获得了5条全长cDNA序列。经与GenBank数据库进行比对，发现其与小鼠已知基因不同源。经GenBank数据库分析，得到可能编码蛋白质的氨基酸序列如下：

      ① 第1条全长cDNA编码蛋白质的氨基酸序列：MSIMDHSPTTGVVTVIVILIAIAALGALILGCWCYLRLQRISQSEDEESIVGDGETKEPFLLVQYSAKGPCVERKAKLMTPNGPEVHG

      ② 第2条全长cDNA编码蛋白质的氨基酸序列：MAAVSVFQPPVGGFSFDNCRRNAVLEADFAKKGFKLPKARKTGTTIAGVVYKDGIVLGADTRATEGMVVADKNCSKIHFISPNIYCCGAGTAADTDMTTQLISSNLELHSLTTGRLPRVVTANRMLKQMLFRYQGYIGAALVLGGVDVTGPHLYSIYPHGSTDKLPYVTMGSGSLAAMAVFEDKFRPDMEEEEAKKLVSEAIAAGIFNDLGSGSNIDLCVISKSKLDFLRPFSVPNKKGTRLGRYRCEKGTTAVLTEKVTPLEIEVLEETVQTMDTS

      ③ 第3条全长cDNA编码蛋白质的氨基酸序列：MTQGVTENKKIQYQDNQTTTGLQFIETRAVLTLRSVEEMSIGEMAGSYSFFPPPP

      ④ 第4条全长cDNA编码蛋白质的氨基酸序列：MPLPVQVFNLQGAVEPMQIDVDPQEDPQNAPDVNYVVENPSLDLEQYAASYSGLMRIERLQFIADHCPTLRVEALKMALSFVQRTFNVDMYEEIHRKLSEATRSSLRELQNAPDAIPESGVEPPALDTAWVEATRKKALLKLEKLDTDLKNYKGNSIKESIRRGHDDLGDHYLDCGDLSNALKCYSRARDYCTSAKHVINMCLNVIKVSVYLQNWSHVLSYVSKAESTPEIAEQRGERDSQTQAILTKLKCAAGLAELAARKYKQAAKCLLLASFDHCDFPELLSPSNVAIYGGLCALATFDRQELQRNVISSSSFKLFLELEPQVRDIIFKFYESKYASCLKMLDEMKDNLLLDMYLAPHVRTLYTQIRNRALIQYFSPYVSADMHRMAAAFNTTVAALEDELTQLILEGLISARVDSHSKILYARDVDQRSTTFEKSLLMGKEFQRRAKAMMLRAAVLRNQIHVKSPPREGSQGELTPANSQSRMSTNM

      ⑤ 第5条全长cDNA编码蛋白质的氨基酸序列：MAAAVVDPQQSVVMRVANLPLVSSTYDLVSSAYVSTKDQYPYLRSVCEMAEKGVKTVTSAAMTSALPIIQKLEPQIAVANTYACKGLDRMEERLPILNQPTSEIVASARGAVTGAKDVVTTTMAGAKDSVASTVSGVVDKTKGAVTGSVERTKSVVNGSINTVLGMVQFMNSGVDNAITKSELLVDQYFPLTQEELEMEAKKVEGFDMVQKPSNYERLESLSTKLCSRAYHQALSRVKEAKQKSQETISQLHSTVHLIEFARKNMHSANQKIQGAQDKLYVSWVEWKRSIGYDDTDESHCVEHIESRTLAIARNLTQQLQTTCQTVLVNAQGLPQNIQDQAKHLGVMAGDIYSVFRNAASFKEVSDGVLTSSKGQLQKMKESLDEVMDYFVNNTPLNWLVGPFYPQSTEVNKASLKVQQSEVKAQ

      • 2.2.   全长cDNA编码蛋白质的理化性质

    • 通过GenBank数据库预测可能编码蛋白质的氨基酸序列，得到5条全长cDNA编码蛋白质的理化性质信息（表 1）。

      编号 氨基酸残基数(个） 相对分子质量 氨基酸平均相对分子质量 等电点 电荷数(pH = 7.0)
      1 88 9 497 107.9 4.99 -2.0
      2 277 29 891 107.9 8.11 4.0
      3 55 6 169 112.2 4.41 -2.0
      4 491 55 536 113.1 6.73 1.5
      5 425 46 646 109.7 6.87 1.5

      表 1  IRM-2小鼠5条全长cDNA编码蛋白质的理化性质

      • 2.3.   全长cDNA的隶属家族

    • 利用Zepfan数据库，寻找5条全长cDNA的隶属家族，其中，3号和4号cDNA在数据库里没有查到隶属家族（表 2）。

      编号 隶属家族
      1 此家族成员含有一个能部分结合到磷脂双分子层的螺旋结构，它与磷脂双分子层表面相互作用，通过结合自由的连接域参与凋亡的启动
      2 此蛋白酶体是一种新型的细胞内复合物，具有15个蛋白水解作用的亚单位。这些亚单位的同类物位于主要组织相容性复合物的两个转运蛋白之间，通过水解细胞内抗原参与抗原递呈
      3 Zepfan数据库里未查到
      4 Zepfan数据库里未查到
      5 属于围脂滴蛋白家族成员，此家族包括脂滴相关蛋白和脂肪分化相关蛋白

      表 2  IRM-2小鼠5条全长cDNA的隶属家族

    3.   讨论

    • cDNA文库构建是用于基因分离、克隆及筛选新基因进而开展基因功能研究的基本手段[4-5]。利用全长cDNA文库不仅能获得完整的目的基因序列和功能信息，还有利于后期蛋白质表达及功能分析。基因差异表达分析是研究相关基因功能的重要手段[6-7]。本研究通过mRNA差异显示获得与已知小鼠基因非同源的21条EST，从构建的IRM-2小鼠全长cDNA文库中获得了5条全长cDNA序列。经GenBank数据库分析，发现与小鼠已知基因不同源，得到了可能编码的蛋白质的氨基酸序列。通过GenBank数据库预测得到了5条全长cDNA编码蛋白质的理化性质，为从分子水平上揭示IRM-2小鼠抗辐射特性的本质奠定了基础。

      物种表现出较强的辐射抗性是极其复杂的生物学过程，除了与修复功能因素有关外，不排除辐射抗性基因或抗性相关基因的表达。本研究在利用Zepfan数据库寻找5条全长cDNA的隶属家族时，发现3号和4号cDNA在数据库里没有查到隶属家族。提示IRM-2小鼠体内可能存在目前尚未发现的辐射抗性相关基因，参与其辐射抗性的形成。通过对辐射敏感性的研究来探讨辐射损伤及其机制是放射生物学研究的热点课题[8-9]，辐射抗性相关基因的发现将对辐射损伤及其修复机制研究提供新的理论依据。在下一步的研究中，我们将观察小鼠胚胎成纤维细胞经照射后全长cDNA的表达和全长cDNA转染对辐射敏感细胞生长的影响，深入探讨全长cDNA在IRM-2小鼠抗辐射机理中发挥的作用。

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