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S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2, SKP2）是由Zhang等[1]在1995年首次发现的，随后，Demetrick等[2]通过荧光原位杂交确定SKP2定位于人类5号染色体短臂一区三带（5p13）。SKP2蛋白属F-box蛋白家族成员，在蛋白泛素化过程中负责对底物的识别，从而促进靶蛋白通过泛素化-蛋白酶体途径降解[3]。目前已知SKP2在细胞周期、细胞凋亡和衰老等调控方面发挥重要作用，但其与肿瘤细胞辐射敏感性的关系报道较少。本研究通过正义转染和RNA干扰等方法研究了SKP2表达对食管癌细胞辐射敏感性的影响。
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食管癌EC9706、KYSE150、KYSE450和KYSE510细胞购自北京协和医学院细胞中心，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液（由天津市津脉基因测绘技术有限公司提供）中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。
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Cammacell-10（Atomic Energy of Canada Lim）137Cs γ射线，剂量率为2.4 Gy/min，总剂量为5 Gy。
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空载体p-pcDNATM 3.1/myc-His A、对照载体Scrambled RNAi、SKP2正义表达载体p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2、RNA干扰载体SKP2 RNAi均由美国Invitrogen公司合成。转染试剂Lipofec-tamine2000购自美国Invitrogen公司。
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分别提取食管癌和癌旁正常组织的总蛋白，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将电泳产物转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h。加SKP2鼠抗人一抗（美国Santa Cruz公司；1:500稀释），4℃反应过夜。经吐温三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤后，加羊抗鼠二抗（天津市津脉基因测绘技术有限公司，1:500稀释），室温培育1 h，加超敏发光液暗室显影。以β-actin（美国Sigma公司；1:5000稀释）作为内参蛋白。
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用空载体p-pcDNATM 3.1/myc-His A和正义表达载体p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2转染经Western-blotting筛选出的SKP2低表达细胞，用Scrambled RNAi对照载体和SKP2 RNAi载体转染筛选出的SKP2高表达细胞。具体方法为将生长状态良好的细胞于转染前一天接种到六孔板中，16~18 h后，细胞总面积达到60%~80%。取5 μl转染试剂Lipofectamine2000加入250 μl RPMI 1640培养液中，同时，将2 μg质粒DNA（美国Invitrogen公司）加入另外250 μl RPMI 1640培养液中，将两者温和混匀，室温放置30 min。细胞先用RPMI 1640培养液洗1~2次，再加入2 ml RPMI 1640培养液。然后将上述混合物轻轻加到培养细胞上。37 ℃条件下培养5 h后，换正常培养液终止转染。24~48 h后收集细胞，检测其瞬时表达情况。如果需筛选稳定细胞株，在48 h后将细胞按1:10传代，然后加入选择抗生素（青霉素和链霉素，美国Sigma公司）进行筛选，每隔2~3 d换液一次，约10~14 d有明显克隆形成，鉴定后保存。
在随后的实验中将细胞分为3组，母系对照组（SKP2低表达或高表达细胞组）、空载转染对照组（Scrambled RNAi或空载组）和转染组（SKP2 RNAi或p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2组，p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2组以下简称为：空载+SKP2组）。
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食管癌细胞经转染和RNA干扰处理后，再接受5 Gy γ射线照射，然后按不同照射剂量接种不同数量的细胞到60 mm的培养皿中。细胞连续培养3周后用甲醇固定，加吉姆萨染液染色30 min，流水冲洗，计数≥50个细胞的克隆数。
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用SPSS16. 0统计软件进行分析。多组间比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
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首先用Western-blotting法检测了4种食管癌细胞中SKP2的表达情况，结果如图 1所示，SKP2在KYSE510中表达水平最高，在KYSE150中表达水平最低，在EC9706和KYSE 450中的表达水平介于二者之间。
图 1 Western-blotting检测SKP2在4种食管癌细胞系中的表达 图中，SKP2为S期激酶相关蛋白，SKP2的表达水平高低依次为KYSE510＞KYSE450＞EC9706＞KYSE150。
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用SKP2正义表达载体p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2转染SKP2低表达细胞KYSE150，筛选稳定克隆后检测SKP2表达，结果如图 2a所示，正义转染后SKP2表达水平显著升高，表明转染成功。用SKP2 RNAi载体转染SKP2高表达细胞KYSE510后，结果如图 2b所示，敲降后SKP2表达降低，表明RNA干扰成功。
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正义转染和RNA干扰后，用5 Gy γ射线照射细胞，结果显示，空载+SKP2组细胞的克隆形成能力显著高于对照组（F=3.53，P＜0.01）（图 3），表明SKP2高表达可以提高食管癌细胞的辐射抵抗能力。敲降SKP2表达后，SKP2 RNAi组细胞的克隆形成能力显著低于对照组（F=5.23，P＜0.05）（图 4），表明SKP2低表达可以增加食管癌细胞的辐射敏感性。
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食管癌是常见的世界十大恶性肿瘤之一，近年来新增患者超过30万人/年，并且大多发生于发展中国家，中国是世界上食管癌高发区，发病率和病死率均居世界之首，每年全世界新诊断出的30万食管癌患者中，1/2以上发生在中国[4]。放射治疗是食管癌的主要治疗手段之一，但不同患者对放射治疗的敏感性存在差异，在相同的放射治疗剂量下，有的患者有效，有的患者无效，还有的患者可能出现严重的不良反应，因此，寻找与食管癌辐射敏感性相关的生物标志物，阐明其分子机理，对指导食管癌的个体化放射治疗有重要意义。
SKP2具有癌基因的潜能，在人类多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的发生、发展和预后密切相关，可能作为肿瘤治疗的新靶点。如Gstaiger等[5]研究发现，SKP2的表达水平从口腔上皮不典型增生到鳞癌逐渐升高，而且SKP2的表达与p27表达呈负相关，集落形成和裸鼠成瘤实验表明，SKP2与人Ras基因共同转染具有很强的恶性转化能力。Yokoi等[6]的研究表明，在25个非小细胞肺癌细胞系中，5个细胞系有SKP2的扩增，11个细胞系SKP2转录水平升高，而且在60例非小细胞肺癌肿瘤标本中，SKP2的表达显著高于正常对照组，SKP2高表达与淋巴结转移、临床分期、分化不良显著相关。在包括前列腺癌[7]、乳腺癌[8]、胃癌[9]、结直肠癌[10]等在内的其他肿瘤中，SKP2高表达也与患者的不良预后相关。但目前关于SKP2与肿瘤辐射敏感性关系的报道还较少。
鉴于SKP2在细胞周期和细胞凋亡调节中的重要作用，我们推测其表达可能对肿瘤细胞的辐射敏感性有一定的影响。为此，我们构建了SKP2表达载体，转染SKP2低表达细胞后检测了细胞辐射敏感性的变化，发现SKP2高表达可以显著提高食管癌细胞的辐射抵抗能力。相反，用RNA干扰技术敲降SKP2高表达食管癌细胞SKP2的表达后，细胞的辐射敏感性显著增加。这些结果证实SKP2的表达水平与食管癌细胞的辐射敏感性密切相关，SKP2可能作为食管癌辐射敏感性的生物标志物及个体化放射治疗的靶点，今后还需要进一步进行分子机理的研究。
SKP2表达对食管癌细胞辐射敏感性的影响
Effects of SKP2 expression on radio-sensitivity of esophageal carcinoma
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摘要:
目的 探讨S期激酶相关蛋白2（SKP2）高表达和低表达对食管癌细胞辐射敏感性的影响。 方法 用Western-blotting方法筛选SKP2低表达和高表达的食管癌细胞系；构建SKP2正义表达载体p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2和RNA干扰载体SKP2 RNAi，分别转染SKP2低表达和高表达的食管癌细胞系，用5 Gy γ射线照射各组细胞，通过克隆形成实验检测细胞辐射敏感性的差异。 结果 SKP2在4种食管癌细胞中的表达水平依次为KYSE510＞KYSE450＞EC9706＞KYSE150。用p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2表达载体转染KYSE150细胞后SKP2表达水平升高，5 Gy γ射线照射后细胞的克隆形成能力显著高于对照组（F=3.53，P＜0.01），表明SKP2高表达可以降低食管癌细胞的辐射敏感性。RNA干扰载体转染KYSE510细胞后SKP2表达水平降低，5 Gy γ射线照射后细胞的克隆形成能力显著低于对照组（F=5.23，P＜0.05），表明敲降SKP2表达可以增加食管癌细胞的辐射敏感性。 结论 SKP2表达与食管癌细胞的辐射敏感性密切相关，具体机制还需要进一步研究。 -
关键词:
- 食管肿瘤 /
- S期激酶相关蛋白质类 /
- RNA干扰 /
- 辐射耐受性
Abstract:Objective To explore the correlation of S-phase kinase-associated protein 2(SKP2) expression with radio-sensitivity of esophageal carcinoma. Methods Detecting the level of SKP2 in four different esophageal carcinoma cell lines using Western-blotting. Constructing p-pcDNATM 3.1/myc-His A-SKP2 expression and SKP2 RNAi vector and transfecting SKP2 low or high expression cell, respectively. Clone forming assay was used to detect the cell proliferation ability of different groups after 5 Gy γ-ray irradiation. Results The sequence of SKP2 expression level in four different esophageal carcinoma cell line was KYSE510 > KYSE450 > EC9706 > KYSE150. Compared with parent control cells, the clone forming ability of SKP2 high expression cells was significantly increased(F=3.53, P < 0.01), showing high SKP2 expression depression the radio-sensitivity of KYSE150 cell. In contrast, the clone forming ability of KYSE510 cell was significantly decreased after SKP2 knock-down(F=5.23, P < 0.05), showing low SKP2 expression promoting the radio-sensitivity of KYSE510 cell. Conclusion SKP2 expression was correlated with radio-sensitivity of esophageal carcinoma, but further study was needed to explore the molecular mechanism. -
图 1 Western-blotting检测SKP2在4种食管癌细胞系中的表达 图中，SKP2为S期激酶相关蛋白，SKP2的表达水平高低依次为KYSE510＞KYSE450＞EC9706＞KYSE150。
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[1] Zhang H, Kobayashi R, Galaktionov K, et al. p19Skp1 and p45Skp2 are essential elements of the cyclin A-CDK2 S phase kinase. Cell, 1995, 82(6): 915-925. [2] Demetrick DJ, Zhang H, Beach DH. Chromosomal mapping of the genes for the human CDK2/cyclin A-associated proteins p19 (SKP1A and SKP1B) and p45(SKP2). Cytogenet Cell Genet, 1996, 73(1-2): 104-107. [3] Wang Z, Gao D, Fukushima H, et al. Skp2: A novel potential therapeutic target for prostate cancer. Biochim Biophys Acta, 2012, 1825(1): 11-17. [4] Lin DC, Du XL, Wang MR. Protein alterations in ESCC and clinical implications: a review. Dis Esophagus, 2009, 22(1): 9-20. [5] Gstaiger M, Jordan R, Lim M, et al. Skp2 is oncogenic and overexpressed in human cancers. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(9): 5043-5048. [6] Yokoi S, Yasui K, Saito-Ohara F, et al. A novel target gene, SKP2, within the 5p13 amplicon that is frequently detected in small cell lung cancers. Am J Pathol, 2002, 161(1): 207-216. [7] Arbini AA, Greco M, Yao JL, et al. Skp2 overexpression is associated with loss of BRCA2 protein in human prostate cancer. Am J Pathol, 2011, 178(5): 2367-2376. [8] Wang Z, Fukushima H, Inuzuka H, et al. Skp2 is a promising therapeutic target in breast cancer. Front Oncol, 2012, 1(57): pii18702. [9] Ma XM, Liu Y, Guo JW, et al. Relation of overexpression of S phase kinase-associated protein 2 with reduced expression of p27 and PTEN in human gastric carcinoma. World J Gastroenterol, 2005, 11(42): 6716-6721. [10] Fujita T, Liu W, Doihara H, et al. Regulation of Skp2-p27 axis by the Cdh1/anaphase-promoting complex pathway in colorectal tumorigenesis. Am J Pathol, 2008, 173(1): 217-228. -
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图(4)
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