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人白细胞介素21（interleukin-21，IL-21）是2000年新发现的细胞因子，人IL-21基因定位于4q26-27，IL-21 cDNA的开放阅读框编码了162个氨基酸残基的多肽前体，信号肽在Gly31部位断裂后形成由131个氨基酸残基构成的成熟肽，分子质量约为15 ×103[1]。IL-21与移植排斥反应[2]及自身免疫病[3]密切相关，并具有抗肿瘤作用[4-5]。本研究采用人IL-21基因重组腺病毒载体（adenovirus vector containing interleukin-21 gene，Ad-IL-21）转染人乳腺癌MCF-7细胞，联合不同剂量γ射线照射，观察IL-21基因联合照射对MCF-7细胞生长的影响，为进一步开展IL-21基因在肿瘤治疗中的应用奠定基础。
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人乳腺癌MCF-7细胞和Ad-IL-21[6]由本实验室构建并保存。RPMI 1640培养基由美国Gibco公司生产，小牛血清和胰酶由北京索莱宝公司生产，噻唑蓝由美国Amressco公司生产，分析纯二甲基亚砜由上海生工生物工程公司生产，酶标仪由美国Thermo公司生产，137Cs γ射线照射源由加拿大USD公司生产，吸收剂量率为0.75 Gy/min。
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MCF-7细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃含5% CO2饱和湿度条件下培养。采用数字随机表法设立空白对照组（不做任何处理）、β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体（adenovirus vector containing β-galactosidase gene, Ad-lacZ）对照组（含lacZ基因但不含IL-21基因的对照腺病毒）、γ射线照射组（137Cs γ射线照射源0~10 Gy照射）、Ad-IL-21组（含IL-21基因的重组腺病毒）和Ad- IL-21联合γ射线照射组（Ad-IL-21转染后6 h进行0~10 Gy照射，简称联合照射组）。
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取对数生长期的MCF-7细胞，按每孔3×103个细胞接种96孔板中，转染当日按上述分组处理，每组6个复孔，每孔加感染复数为100的Ad-IL-21（病毒滴度为9×1010 PFU/ml）稀释液。转染6 h后进行γ射线照射。每组分别于处理后培养48 h，加入0.5%噻唑蓝液20 μl，孵育4 h后用酶标仪测定492 nm处的吸光度（A492）值，按照下面公式计算细胞生长的抑制率：
$ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;\;\;\;{\rm{抑制率}}\left( \% \right) = \left( {1 - {{\rm{实验组}}{\rm{A}}_{492}}{\rm{值}}/{\rm{对照组}}{{\rm{A}}_{492}}{\rm{值}}} \right) \times \\ 100{\rm{\% }}。 \end{array} $ -
采用SPSS 16.0软件进行方差分析比较存活细胞数量，P＜0.05为差异有统计学意义。
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Ad-IL-21转染MCF-7细胞后，MCF-7细胞生长受到的抑制效应明显，抑制率高达18%，与Ad-lacZ组比较，差异有统计学意义（F=26.34，P＜0.05），而Ad-lacZ组对肿瘤生长影响不大（图 1）。研究结果表明，IL-21基因对MCF-7细胞的生长具有抑制作用。
图 1 Ad-IL-21转染对MCF-7细胞生长的抑制率 图中，Ad-lacZ为β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体；Ad-IL-21为人白细胞介素21基因重组腺病毒载体。
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Ad-IL-21转染MCF-7细胞6 h后进行γ射线照射，发现单独照射组和联合照射组的抑制率均显著高于Ad-IL-21组（F=23.51，F=27.55，P均＜0.05），随着照射剂量的增大，抑制率逐渐增高，从10%上升至40%以上（图 2）。联合照射组抑制率最高，达50%。同一照射剂量中，联合照射组的抑制作用均明显高于照射组，与Ad-IL-21组和照射组比较，差异具有统计学意义（F=35.68，F=38.67，P均＜0.05）。研究结果提示，IL-21基因与γ射线联合应用具有协同抑瘤效应，抑制细胞生长的作用更强。
图 2 Ad-IL-21联合γ射线照射对MCF-7细胞的抑制率 图中，Ad-IL-21为人白细胞介素21基因重组腺病毒载体。
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IL-21具有广泛的免疫调节功能[1]，是免疫调控网络中的重要细胞因子，能够对B细胞、T细胞、自然杀伤细胞等产生作用，它可以调控B细胞的分化、凋亡及产生抗体的亚类，促进T细胞介导的获得性免疫，增强自然杀伤细胞的细胞毒性及产生干扰素-γ的能力，介导主动免疫与被动免疫之间的转换，发挥强大的抗肿瘤免疫作用[4-5]。有研究报道，将IL-21基因转染到人胰腺癌细胞能产生自然杀伤细胞依赖性和非依赖性抗肿瘤效应，IL-21基因治疗有望在将来的肿瘤生物治疗中发挥重要作用[7]。
恶性肿瘤的治疗包括手术、放疗、化疗和生物治疗。基因治疗是生物治疗的内容，肿瘤基因治疗是通过一定方式将外源性基因导入目的肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
近年来基因治疗技术正日益渗入到放射治疗中去。美国肿瘤放射治疗学家提出了“基因放射治疗法”一词，其含义是放疗既可有效地控制肿瘤的生长，降低肿瘤负荷，又可促进基因载体的高效肿瘤靶向转移，为基因治疗疗效的发挥创造有利条件，而基因的导入又可增强放疗疗效，放疗与基因治疗联合应用具有相互促进的作用[8]。
如何将基因治疗与放疗手段有机结合起来，以及如何进行准确的疗效评价，已成为肿瘤治疗研究中的方向之一。
在本研究中，Ad-IL-21转染MCF-7细胞后，MCF-7细胞生长受到的抑制效应显著高于Ad-lacZ组，结果表明，IL-21基因对MCF-7细胞的生长具有一定的抑制作用。Ad-IL-21转染MCF-7细胞后进行γ射线照射，发现单独照射组和联合照射组的抑制率均明显高于Ad-IL-21组，随着照射剂量的增大，肿瘤细胞的抑制率逐渐增高，这与相关报道[9]结果一致。同一照射剂量中，联合照射组的抑制作用均显著高于γ射线照射组，结果提示，IL-21基因能增强肿瘤细胞对γ射线的敏感性，基因治疗与放疗联合应用对肿瘤细胞具有协同抑制效应，抑制细胞生长的作用更强，与文献结果一致[10-11]。本研究为乳腺癌的基因治疗联合放疗研究以及可能的临床应用提供了理论基础和实验依据。
白细胞介素21基因联合不同剂量γ射线照射对乳腺癌细胞生长的影响
Effects of interleukin-21 gene combined with different doses of γ-ray radiation on growth of breast carcinoma cells
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摘要:
目的 研究人白细胞介素21基因重组腺病毒载体（Ad-IL-21）联合不同剂量γ射线照射对人乳腺癌细胞体外生长的抑制作用。 方法 采用随机数字表法设立空白对照组、β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体（Ad-LacZ）对照组、Ad- IL-21组、γ射线照射组和Ad- IL-21联合γ射线照射组（联合照射组），将Ad-IL-21于体外转染人乳腺癌MCF-7细胞，转染6 h后进行0~10 Gy 137Cs γ射线照射，用噻唑蓝法检测MCF-7细胞的生长抑制率。 结果 Ad-IL-21转染MCF-7细胞后，MCF-7细胞生长受到的抑制效应显著高于Ad-lacZ组（F=26.34，P＜0.05），单独照射组和联合照射组的抑制率均显著高于Ad-IL-21组（F=23.51，F=27.55，P均＜0.05），随着照射剂量的增大，细胞抑制率逐渐增高。同一照射剂量中，联合照射组对MCF-7细胞的抑制作用均显著高于γ射线照射组，联合照射组抑制率最高，与Ad-IL-21组和γ射线照射组比较，差异具有统计学意义（F=35.68，F=38.67，P均＜0.05）。 结论 IL-21基因联合γ射线照射对乳腺癌细胞的抑瘤作用具有协同效应，有效地抑制肿瘤细胞的生长。 Abstract:Objective To study the effect of recombinant adenovirus vector carrying interleukin-21 gene(Ad-IL-21) combined with different doses of γ-ray radiation on the growth of breast neoplasms. Methods MCF-7 cells were transfected by Ad-IL-21 and exposed from 0 to 10 Gy 137Cs γ-ray 6 h after transfection. The cohorts were divided into 5 groups:blank control group, adenovirus vector containing β-galactosidase gene(Ad-LacZ) group, Ad-IL-21 group, γ-ray radiation group and Ad- IL-21 combined with radiation group. The inhibition rates of MCF-7 cells were detected by MTT assay. Results MCF-7 cells transfected with Ad- IL-21 were inhibited significantly greater than that of Ad-LacZ(F=26.34, P < 0.05). The inhibition rates of γ-ray radiation group and Ad-IL-21 combined with radiation group were significantly higher than that of Ad- IL-21 group(F=23.51, F=27.55, both P < 0.05)and the inhibition rate increased when γ-ray radiation doses increased. The inhibition rate of Ad- IL-21 combined with radiation group was higher than that of γ-ray radiation group at the same dose. The inhibition rate of Ad- IL-21 combined with radiation group was the highest, which was significantly higher than that of Ad- IL-21 group and γ-ray radiation group(F=35.68, F=38.67, both P < 0.05). Conclusion The recombinant Ad- IL-21 transfection combined with γ-ray radiation shows the synergism for the inhibition of the growth of MCF-7 cells. -
Key words:
- Breast neoplasms /
- Gene /
- Interleukin-21 /
- Radiotherapy /
- Gene therapy
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[1] Parrish-Novak J, Dillon SR, Nelson A, et al. Interleukin 21 and its receptor are involved in NK cell expansion and regulation of lymphocyte function. Nature, 2000, 408(6808): 57-63. doi: 10.1038/35040504 [2] Borte S, Pan-Hammarström Q, Liu C, et al. Interleukin-21 restores immunoglobulin production ex vivo in patients with common variable immunodeficiency and selective IgA deficiency. Blood, 2009, 114(19): 4089-4098. doi: 10.1182/blood-2009-02-207423 [3] Monteleone G, Sarra M, Pallone F. Interleukin-21 in T cell-mediated diseases. Discov Med, 2009, 8(42): 113-117. [4] 苗莉, 缪竞诚.细胞因子在急性辐射损伤治疗中的作用.国际放射医学核医学杂志, 2006, 30(3): 173-176. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2006.03.014
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