靶向CD13/APN的工具有3种: CD13抑制剂^[4]、CD13配体和CD13单克隆抗体, 其中应用较多的是CD13配体天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸(Asn-Gly-Arg, NGR)和CD13单克隆抗体。CD13配体NGR追踪CD13/APN, 结构有2种: 环状NGR(circle NGR, cNGR)、线状NGR^[5]。通过NGR追踪肿瘤新生血管内皮细胞表面的CD13/APN, 能从体内、体外两个方面实现对肿瘤的识别^[6]。同时, CD13/APN对于肿瘤新生血管的发生、细胞外基质的降解、肿瘤的侵入均有调节作用, NGR携带CD13抑制剂阻碍CD13对肿瘤的各种调节作用, 达到控制肿瘤发生、发展的目的。NGR携带肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、多柔比星、干扰素γ(interferon-γ, INF-γ)等抗肿瘤药物通过靶向肿瘤血管内皮细胞来治疗肿瘤已取得了一定的成效^[5]。

用WM15、3D8和BF10(3种CD13的单克隆抗体)对58例正常组织、32例炎症、149例肿瘤进行免疫组化法血管染色, 结果: 这3种抗体均能标记肿瘤组织, 约半数的肿瘤组织基质也有着色, 不同的是: WM15标记肿瘤内外的毛细血管, 大血管的着色极少, 而BF10和3D8标记动脉、静脉, 对毛细血管着色的范围小得多, 由此可见, WM15对于新生毛细血管内皮细胞表达的CD13/APN有特异性结合作用; 在炎性病灶中, 3种抗体均标记血管和基质; 在正常组织中, 它们仅着色小部分的血管, 包括人脐静脉内皮细胞和结肠癌血管^[7]。此3种单克隆抗体不仅在靶向示踪CD13中起到重要的作用, 还能携带显像剂、抗疾病药物在新生血管中发挥诊断和局部治疗的作用。

新生血管对器官的生长和修复有很重要的作用, 在促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡被打破时, 就会出现缺血、炎症、感染、免疫紊乱, 甚至肿瘤^[8-9]。CD13/APN是体内外血管内皮细胞的迁移、入侵和毛细血管生成的关键因子^[3]。Pasqualini等^[6]用NGR靶向追踪肿瘤新生血管内皮细胞的CD13/APN, 证明CD13/APN是NGR的靶向受体, 是新生血管的靶目标。CD13/APN选择性地表达于血管内皮细胞, Fukasawa等^[10]证实, CD13/APN在人脐静脉内皮细胞和21种肿瘤细胞系中的18种有高表达, 而在5种正常细胞中仅1种正常细胞有表达。Curnis等^[1]用NGR-TNF复合物和13Co3、WM15两种单克隆抗体证明, CD13在肾癌、乳腺癌和前列腺癌中的髓细胞、上皮细胞和肿瘤血管中表达, 而在正常肾脏和正常髓细胞中并不表达。由此可见, CD13只在活化的血管内皮细胞中表达。Oostendorp等^[11]通过顺磁性量子(paramagnetic quantum dots, pQDs)与NGR结合对急性心肌梗死后新生血管区行分子MRI证实, CD13在有活性的内皮细胞表面高表达(如肿瘤、炎症组织中的新生血管), 而在静止的细胞和正常的细胞中很少表达或者不表达。

Oostendorp等^[12]用cNGR标记的顺磁性量子(cNGR-pQDs)进行荷瘤鼠靶向性MRI, 可见肿瘤边缘显像, 而肿瘤核心并不显像, 说明对肿瘤的增长和扩散有重要意义的血管在肿瘤边缘生成、活跃; 而未标记cNGR的pQDs在MRI和双光子激光扫描显微技术中都不显像或显像很少, 证明cNGR是与肿瘤血管内皮结合的功能部位。

综上所述, 在各种刺激因子打破血管生成平衡的条件下, CD13/APN在新生血管内皮细胞表面大量表达, 在静止的血管内皮细胞中的不表达或表达较少, 因而不能被配体或单克隆抗体追踪。

CD13/APN是新生血管发生的关键因子, 而CD13/APN在血管生成的平衡打破之后在各种因素的刺激下上调, 实现血管生成的调节。Petrovic等^[13]证实, CD13通过调节膜依赖的缓激肽介导的细胞分裂周期蛋白42(cell division cyclin 42)以及伪足伸出情况来调节血管生成。在缺氧、血管生长因子、血管生成调节信号的调节下, CD13近端启动子活跃, 转录大量增加, 立即提高CD13的表达, 促进毛细血管的生成, 以此对微环境发生的改变做出应答^[2]。CD13/APN在成熟血管内皮细胞内静止, 肿瘤在微环境改变后产生血管生成因子, 调节CD13/ APN大量表达。这一上调是通过Ras蛋白的活化来启动Ras信号途径, 并由Ras蛋白激活信号通路下游目标的调节器而完成。

Bhagwat等^[3]报道, CD13的上调是通过新生血管信号转导而实现的, 而信号的转导是通过Ras蛋白/丝裂原激活蛋白激酶(Ras/mitogen activated protein kinase)、Ras蛋白/磷脂酰肌醇3-激酶(Ras/phosphatidylinositol 3-kinases)两条信号转导通路刺激CD13/APN近端启动子的转录而完成的。Ras蛋白介导的信号转导对生长因子介导的血管生成是必需的, 因为抑制Ras蛋白激活的信号转导通路下游的调节器, 能够抑制内皮细胞的迁移、入侵和形态的发生, 而CD13的再诱导克服了这些抑制作用, 恢复内皮细胞的迁移、入侵和形态发生的功能; 对细胞外信号调节丝氨酸/苏氨酸激酶(extracellular signal-regulated serine/threonine kinase)通路的抑制, 可以消除内皮细胞的入侵和毛细血管的形成, 但是此抑制作用可由外源性CD13有效地补救。可见, CD13是Ras蛋白介导的Ras信号途径信号转导的靶目标, 是新生血管发生过程的关键因子。Petrovic^[14]等从RNA转录水平进一步证明, CD13/APN的信号转导是由Ras/丝裂原激活蛋白激酶信号转导通路中的CD13/APN启动子中38对碱基对区域中的Ets-2基因实现磷酰化, 从而调节CD13/APN的诱导; 对比试验显示, Ets-2基因敲除后的内皮细胞和包含抑制Ets-2基因的干扰RNA的内皮细胞完全失去了调节内皮细胞形态的功能, 而未磷酰化的Ets-2基因并不能转录、活化CD13/APN, 可见Ets-2基因的磷酰化对于CD13/APN诱导是必不可少的。

肿瘤的生存和生长依靠血管供给养分和排除废物, 同时肿瘤的转移也依赖新生血管, 因此, CD13/APN在新生血管内皮细胞的特异性高表达为亲肿瘤显像提供了很好的靶目标。Pasqualini等^[6]用NGR与肿瘤新生血管内皮细胞表面表达的CD13/ APN结合, 实现靶向追踪肿瘤。Ikeda等^[15]在免疫组化染色、计数微血管中利用CD13的单克隆抗体MH8-11在50例胰腺癌患者体内发现, CD13/APN基因表达阳性率为50%, 而CD13/APN蛋白阳性率为48%;CD13/APN阳性表达患者的半生存时间远远短于CD13/APN阴性表达的患者。Tokuhara等^[16]同样运用CD13的单克隆抗体MH8-11在研究中发现, CD13/APN是患非小细胞肺癌的重要先兆因素: 在194例非小细胞肺癌中, CD13/APN参与降解细胞外基质、活化细胞和增加血管生成。以上两项研究说明, CD13/APN的表达情况对于预测癌症的发生、发展及生存时间的长短有着重要的参考价值。Oostendorp等^[12]运用pQDs和cNGR-pQDs对肿瘤和肌肉组织行MRI, 结果: cNGR-pQDs的反应范围较未标记cNGR的pQDs大3倍, cNGR-pQDs与肿瘤边缘的新生血管内皮细胞结合, 而非肿瘤内部组织, 支持了新生血管的形成在肿瘤边缘活跃的观点; 同时, cNGR-pQDs在肿瘤组织中的分布高于肌肉组织2倍, 支持了cNGR-pQDs对新生血管有特异性的观点; cNGR-pQDs与新生血管内皮细胞的结合是可逆的, 并可由未结合的cNGR竞争抑制。这些结果在体外由双光子激光扫描显微技术所证实。cNGR-pQDs的肿瘤MRI实现了无创性地在数量上评估新生血管的活性, 从而可用于判断肿瘤良恶性、监测肿瘤的生长和转移、估测肿瘤对药物治疗反应的情况。

急慢性心肌梗死后, 形成侧支循环, Buehler等^[17]用体内荧光显像和体外双光子激光扫描显微技术来获得心肌梗死后模型中CD13在新生血管和非新生血管中的分布, 结果显示: CD13/APN在心肌梗死后新生血管区优先表达; 在反转录聚合酶链反应中可测得CD13 mRNA的表达在梗死区和梗死边缘区显著上调, 在心肌梗死后7 d达到峰值, 增长10~20倍, 而在非梗死区和手术安装的假心脏组织基本不变, 且梗死区与cNGR标记区的空间位置关系一致; CD13/APN联合CD105和CD31共同定位于直径小于15 μm的血管中, 而cNGR不与正常心肌组织中的CD13阳性血管结合, 再次证明cNGR只与活化的血管内皮细胞中的CD13/APN结合。

NGR作为CD13/APN的配体可以与各种抗肿瘤药物结合成抗肿瘤复合物, 靶向肿瘤新生血管内皮细胞释放抗肿瘤药物, 发挥其抗肿瘤效用。近年来, 研究者们将抗肿瘤药物、细胞活性因子、抗血管生成因子与cNGR结合成为抗肿瘤复合物, 靶向追踪CD13/APN, 用以发挥它们杀伤新生血管和肿瘤的效能^[5]。其中, Curnis等^[1]发现, cNGR-TNF-α 20~30倍高效于TNF-α, 从而大大降低了大剂量TNF-α的系统细胞毒性, 突破其局部给药的限制。Curnis等^[18]还发现, 低剂量cNGR-INF-γ(0.06~3 ng)可以活化依赖TNF的抗肿瘤机制, 高剂量cNGR-INF-γ(300 ng)诱导可溶性坏死因子受体脱落, 提示低剂量靶向方法可以使抗肿瘤和抗调节机制解耦联, 说明NGR是理想的运送细胞因子到肿瘤内的靶向工具。

NGR不仅可以结合抗肿瘤药物, 而且可以联合NGR-复合物和抗肿瘤药物发挥协同抗肿瘤作用。有研究报道, NGR-TNF与多柔比星的协同抗肿瘤作用在具有免疫力的小鼠中出现, 而在无胸腺裸鼠和敲除INF-γ基因的鼠体内没有出现, 加入抗INF-γ抗体的免疫小鼠体内协同作用同样消失; 对无胸腺裸鼠和敲除INF-γ基因小鼠给予INF-γ, 协同作用恢复; 在裸鼠体内加入INF-γcDNA, 同样使协同作用恢复^[19]。总之, NGR携带多重抗肿瘤药物可以发挥各药物的协同作用。CD13/APN作为受体与NGR携带的抗肿瘤药物结合, 能在低剂量水平实现抗肿瘤作用, 提高抗肿瘤效用, 同时减少高剂量抗肿瘤药物对人体正常组织损害的不良作用。此外, CD13抑制剂对于实体瘤的治疗作用也取得了令人鼓舞的成果, 尤其对于肺鳞癌、非小细胞肺癌治疗后5年的生存率均有提高^[4]。

NGR是CD13/APN的配体, 其异构体精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)可与整联蛋白αv家族中的整联蛋白αvβ3结合, 整联蛋白αvβ3也是表达于血管内皮细胞的靶向受体。整联蛋白αvβ3和CD13/APN虽然同时表达于新生血管内皮细胞, 但并不是同一种物质^[20]。放射性核素标记的RGD引入体内后, 可以与整联蛋白αvβ3特异性结合, 在体外可以用核医学检测仪器无创性检测, 进而根据放射性化合物的异常浓聚提示肿瘤的大小, 判断抗肿瘤血管生成药物的疗效。在未来的研究中, 可以借鉴放射性核素标记RGD与整联蛋白αvβ3结合的方式, 用放射性化合物标记NGR追踪CD13/APN显像, 进而判断新生血管支持的疾病的发生、发展、治疗效果等。

RGD血管靶向整联蛋白αvβ3与NGR靶向CD13/APN的结合, 使受体靶向诊断和治疗不仅仅局限于CD13/APN这一种新生血管内皮细胞标志物, 同时也为多种受体抗体、配体、单克隆抗体联合, 发挥诊断、治疗作用提供了更广的思路和方法。