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肿瘤生长抑素受体显像的成功应用极大地推动了肿瘤受体显像的发展,也促进了受体介导的靶向治疗研究,在肿瘤的个性化诊疗中日益发挥重要作用[1]。血管活性肠肽受体(vasoactive intestinal peptide receptor,VIPR)在多种肿瘤细胞膜中高水平表达且密度高于生长抑素受体,为肿瘤VIPR显像及靶向治疗研究奠定了基础,本文就VIPR显像及治疗研究进展作一综述。
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VIP是由Said和Mutt[2]从猪小肠中分离得到、由28个氨基酸组成的直链小分子多肽,属胰高血糖素-胰泌素家族。编码VIP的基因为单拷贝基因,定位于第6号染色体长臂近末端处,全长为8837bp,该基因编码产生170个氨基酸的前VIP蛋白,后者经胰蛋白酶类酶、羧基肽酶B类酶和肽-α-加单氧酶等酶解,最终产生由28个氨基酸组成的VIP和由27个氨基酸组成的组甲肽(peptide histidine methionine,PHM)。VIP结构包括N末端无序结构区和α螺旋域,其余氨基酸残基在C末端形成螺旋样结构,N端和C端区域对VIP生物活性及识别特异性受体有重要作用[3]。VIP广泛存在于人体的多种组织器官中,不同组织中的分布浓度不同;VIP主要通过肝脏代谢,肾脏排泄,发挥舒张血管、扩张支气管、抗炎、免疫抑制、激素分泌及细胞增生等生理作用,在循环中的半衰期仅1~2 min,正常时不起循环激素作用。
VIPR属于七次跨膜G蛋白耦联受体家族,广泛存在于多种正常组织器官细胞膜表面。整个受体包括3个部分:N-末端胞外域,含一个疏水的N端信号肽以及VIP结合位点;跨膜域,含七个疏水的跨膜片段;C-末端胞质域,与信号转导相关。VIP氨基酸残基的C末端与其受体N末端相结合,引起受体构象改变而导致受体胞内域的丝氨酸和苏氨酸磷酸化,再经GαS蛋白(一种激动型G蛋白)介导,激活腺苷酸环化酶,使胞内环一磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平增高,激发一系列信号转导,调节多种生理功能[4]。VIPR存在3种不同亚型,由国际药理联合会分别命名为VPAC1、VPAC2和PAC1,它们对不同配体及类似物有不同的亲和力,其中VPAC1和VPAC2对VIP和垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyase activating polypeptide, PACAP)具有相似的高亲和力,而PAC1是PACAP的特异性受体,与PACAP的结合力是VIP的300~1000倍[5-6]。在人类组织中,VIP主要高亲和性地结合VPAC1和VPAC2两种受体亚型,而发挥正常的受体调节功能需要完整的跨膜结构,实验证实,只有五次跨膜结构的VPAC1和VPAC2变异体不能进一步激发体内第二信使的产生,因此不能完成正常的信号转导[7]。
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放射性核素受体显像与受体介导的靶向治疗属于分子显像与分子治疗的范畴,其前提和基础是靶组织及细胞应该高水平表达相应的受体。Reubi等[8]通过放射自显影研究证实,VIPR在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、胃肠道鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、角质细胞瘤等肿瘤组织中高密度表达。不同的VIPR亚型在肿瘤中有不同的表达,其中结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及肝癌等肿瘤细胞高表达VPAC1,是恶性肿瘤细胞最常表达的受体类型[9-10];而VPAC2仅在平滑肌肉瘤、纤维肉瘤等良性肿瘤表面有限表达[9];PAC1则主要表达于神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑垂体腺瘤等神经内分泌性肿瘤。经研究发现,VIPR在恶性肿瘤及其转移灶中高水平表达,并且肿瘤组织高亲和力VIPR最大结合位点是正常组织的22.5~57.9倍[11],有助于肿瘤显像获得高T/NT值,为开展肿瘤的受体显像研究提供了分子基础,肿瘤表面受体亚型的差异性表达也为设计针对特定受体亚型的分子显像剂和靶向治疗制剂奠定了理论基础。
研究发现,多种肿瘤患者血清VIP浓度增加[12-13],由此推测,VIP可能与肿瘤发生进展有相关关系。通过对荷瘤裸鼠的研究证实,VIP能够增加血管内皮生长因子的表达和肿瘤血管密度,从而促进肿瘤新生血管的生成和肿瘤生长,该调节作用主要通过VIPR介导,经cAMP/蛋白激酶A和磷脂酰肌醇激酶3信号通路而刺激血管内皮生长因子表达[14-15]。Valdehita等[16]证明,VIP能够诱导VPAC1的内化和核定位,通过信号转导调节表皮生长因子受体等基因表达,从而促进肿瘤生长进展。这些研究表明,VIP可以通过受体介导,调节肿瘤的增殖、分化,为发展受体拮抗剂和VIP类似物联合放化疗的肿瘤靶向治疗提供了实验依据。
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Virgolini等[17]率先开展了123I-VIP的肿瘤受体显像研究:123I-VIP经标记、纯化后,比活度大于500 TBq/mmol,注射入人体后未出现严重不良反应,血循环半清除时间大约1 min,注射后10 min,大部分放射性被肺组织摄取,肾脏有效半排时间为6.2 h左右,肺和膀胱为123I-VIP主要集聚器官,肝、脾和正常胃肠道组织的摄取量相对较少,对于胃肠道肿瘤显像效果较好;123I-VIP显像能够检出直径小于2 cm的肿瘤,甚至能显示CT未能发现的部分类癌,而显像的肿瘤类型多于生长抑素受体显像,并且在123I-VIP显像阳性的17例结肠腺癌病例中,生长抑素受体显像仅检出4例阳性病例,123I-VIP显像的阳性检出率明显高于生长抑素受体显像。Raderer等[18-19]应用123I-VIP对结直肠癌和胰腺癌的显像结果表明,结直肠癌中87%的原发灶及82%的局部复发灶均能清楚显示,并且能检出89%的肝转移以及所有的淋巴结转移灶;能够显示约90%的胰腺原发肿瘤及其肝转移病灶。总之,123I-VIP显像能比CT更早发现原发肿瘤病变,有利于肿瘤的早期诊断和治疗。但是,VIP在体内循环的有效半衰期仅1~2 min,极易受蛋白酶降解,而且VIP存在潜在的致瘤效应;此外,123I须通过回旋加速器生产,费用昂贵,且123I-VIP标记后需分离纯化,故难以在临床推广应用。
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为克服123I-VIP显像存在的不足,有研究应用99Tcm通过双功能螯合剂巯基乙酸-三甘氨酸((N-(N(N-(benzylthio)acetyl)glycyl)glycyl)glycin, MAG3)和甲酰四环烷-4-苯甲酸(4-((1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradec-1-yl)methyl)benzoic acid, CPTA)对VIP进行间接法标记,但结果显示,得到的标记物的放化纯度低,制备后需分离纯化,生物结合活性明显降低,难以获得较好的显像结果[20-21]。Virgolini等[22]通过合成VIP类似物P1666并用99Tcm标记,对15例结肠癌患者进行显像,结果显示:肺放射性摄取低于123I-VIP,且24 h后肺内放射性下降99.6%;T/NT值为2.6~3.7,注射后24 h显像,肿瘤原发灶仍清晰可见,肿瘤阳性检出率约为60%;但超过50%的患者出现轻重不等的不良反应,极大地限制了其临床应用。Thakur等[21,23]报道,将天然VIP28的羧基端耦联γ-氨基丁酸作为连接支架,再连接四个氨基酸的甘氨酸-甘氨酸-(γ-氨基丁酸)-丙氨酸-甘氨酸[GG(D)AG],得到TP3654,其中GG(D) AG作为与99Tcm螯合的4N结构,可成功进行VIP的99Tcm标记;碱性条件下,99Tcm-TP3654的标记率可达99%,体内稳定且与VIPR的结合活性无明显变化,生物活性与天然VIP相似;注射入人体后无不良反应,24 h后有70%放射性通过泌尿系统排泄,约20%通过肝胆排泄,其余正常组织器官摄取较少;注射后15 min内能清楚显示所有高表达VIPR的肿瘤;由于99Tcm-TP3654大部分通过泌尿道和肝胆排泄,后者对腹部肠道肿瘤显像有一定干扰,但通过体内动力学实验表明,该显像剂在肝胆系统排泄较缓,而肿瘤摄取显像剂较快,因此对肠道肿瘤的探测明显优于生长抑素受体显像。
Kothari等[24]在已有的研究基础上,将3种VIP类似物VP05、VD4、VD5(分别为经第28、第20、第19位残基修饰、固相合成得到的不同分子质量的VIP类似物)与[99Tcm(OH2)3(CO)3]+混合反应,分别得到3种99Tcm(CO)3-VIP类似物,标记率均大于95%,室温下非常稳定;它们主要通过肝胆和肾排泄,肿瘤摄取显像剂较99Tcm-TP3654高。但3种99Tcm(CO)3-VIP类似物被软组织摄取相对较多,本底较高,需进一步改进其体内分布特性。
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与SPECT相比,PET具有更加优越的灵敏度和分辨率,因此用正电子核素标记的VIP类似物的PET显示出良好的应用前景。Moody等[25]率先用18F通过酰化一步法标记VIP类似物(Arg15,Arg21) VIP,得到18F-RR-VIP,发现其能与肿瘤VPAC1高选择性结合,发挥VIPR激动剂的功能;对乳腺癌动物模型显像发现,注射1~2 h后,各正常组织放射性明显降低,肿瘤影像清晰,注射后4 h延迟显像示肿瘤组织放射性约为正常组织的4~15倍,并且甲状腺和肺组织的放射性本底较低,对乳腺癌的显像明显优于123I-VIP。为进一步提高18F标记VIP类似物的稳定性,避免体内过快的水解反应,Cheng等[26]成功合成了[R8,15,21,L17]-VIP(该VIP类似物为第8、第15、第21位用精氨酸代替,第17位由亮氨酸代替),并通过三步法和一步法分别与N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(N-suc-cinimidyl-4-18F-fluorobenzoate4,18F-SFB)和-琥珀酰亚胺-4-18F-(氟甲基)苯甲酸酯(N-succinimidyl-4-18F(fluoromethyl)-benzoate6, 18F-SFMB)反应、制备得到18F-FB-[R8,15,21,L17]-VIP7和18F-FMB-[R8,15,21,L17]-VIP8,它们具有更高的体内、外稳定性和受体结合亲和力,但需进一步的荷瘤动物显像实验来评价其有效性。
64Cu的半衰期适中且标记后不需分离纯化,Zhang等[27]合成3种特异性VIP类似物TP3939、TP3982、TP4200(3种分子质量分别为3939、3982、4200的合成肽),并用64Cu标记,所得3种标记物的生物活性与天然VIP相似,经放射性配体结合分析显示,其与乳腺癌组织的结合率是正常乳腺组织的2.17~10.93倍;血液半清除时间为3.0~3.5 min,血液中97%以上的放射性为标记化合物原型,仅少量游离64Cu与血浆蛋白结合。他们进一步报道,合成后的64Cu-TP3939放化纯约为98%,血浆蛋白结合率低于15%,对前列腺癌荷瘤小鼠显像发现,静脉注射后,血液放射性清除快,4 h和24 h肿瘤摄取分别为(7.48±3.63)%ID/g和(5.78± 0.66)%ID/g,T/NT值分别为4.0和2.7;64Cu-TP3939能灵敏地显示18F-FDG和CT探测不到的前列腺上皮内瘤变,并能定位复发肿瘤和判断治疗效果,是一种最具潜力的新型PET显像剂[28]。
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VIP能通过其受体介导,调节肿瘤的增殖与分化,而竞争性拮抗剂可以抑制VIP与受体结合,阻止受体信号转导,发挥抑制肿瘤生长的作用。一种由神经降压素和VIP杂合得到的VIPR拮抗剂neurotensin6-11-VIP7-28的抗肿瘤研究表明,该拮抗剂能够显著抑制80%的裸鼠成瘤,体外能抑制50%的肿瘤细胞集落形成;对神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌等肿瘤生长有显著抑制作用,能够明显缩小瘤体体积、减少淋巴结侵袭以及改善肿瘤分期[29]。在neurotensin6-11-VIP7-28的N末端加上硬脂酰,并在第17位用亮氨酸替换甲硫氨酸得到(SN)VIPhyb,该拮抗剂能竞争性抑制VIPR的3种亚型VPACA1、VPACA2和PAC1,其中与VPAC1的结合力约为neurotensin6-11-VIP7-28的10倍,能够显著抑制VIP诱导的cAMP的增加和c-fos基因的表达[30]。
neurotensin6-11-VIP7-28和(SN)VIPhyb与化疗药物对肿瘤具有协同抑制作用,两者均能增强化疗药物的抗肿瘤作用,与化疗药物联用能够增强肿瘤的杀伤效应。Moody等[31]在VIP的C末端通过短肽链丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(ALALA)和亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(LALA)与化疗药物玫瑰树碱(ellipticine)连接,分别得到复合物VIPALALA-ellipticine和VIP-LALA-ellipticine,这两者均能诱导VIPR介导的cAMP升高和c-fos上调,发挥VIPR激动剂的作用。该复合物与VPAC1结合后,受体-VIP-ellipticine复合物内吞入溶酶体,经内源性酶解后释放化疗药物,发挥细胞毒作用而杀伤肿瘤细胞,能够有效抑制乳腺癌和肺癌等肿瘤细胞的增生和存活[31-32]。随后,Moody等[33]又合成了VPAC1的特异结合物(A-NL-K)-VIP,通过N-甲胺-乙烷-甘氨酸(L2)与喜树碱(camptothecin)连接,得到复合物(A-NL-K)-VIP-L2-camptothecin,该复合物能够有效杀灭乳腺癌细胞,但尚需进一步的体内试验来验证其抗瘤效应及安全性。
对于VIPR介导的放射性核素治疗研究,报道较少,有待于通过开展研究来验证其有效性和安全性。VIPR介导的核素治疗应该在肿瘤高水平表达VIPR的基础上,选用合适的治疗核素,确保治疗用的放射性标记配体具有高比活度,与肿瘤组织的结合有高选择性和高亲和力,在达到对肿瘤有效治疗的同时,减少对正常组织器官辐射损伤的目的。
综上所述,肿瘤分子核医学显像诊断与靶向治疗在肿瘤防治中有重要意义,而肿瘤特异性的分子靶标是显像与治疗的关键,多种肿瘤组织高表达VIPR,为放射性核素标记VIPR显像与治疗提供了分子基础。近年来,基于肿瘤VIPR的SPECT和PET研究得到极大发展,同时针对VIPR的生物靶向治疗也有望成为新型的肿瘤靶向治疗药物, 但如何提高放射性核素标记物的体内外稳定性、提高T/NT值、增强肿瘤显像及靶向治疗的特异性、减少正常组织器官的放射性损伤,是完善肿瘤VIPR显像及治疗的关键。相信随着进一步的研究和发展,肿瘤VIPR显像与靶向治疗将在临床中得到广泛应用。
血管活性肠肽受体显像及治疗研究进展
Advances on the imaging and therapy of vasoactive intestinal peptide receptor
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摘要: 血管活性肠肽（VIP）是由28个氨基酸组成的小分子多肽，属胰高血糖素-胰泌素家族，通过其受体（VIPR）介导，调节正常及肿瘤细胞的增殖与分化。多种类型的肿瘤细胞膜上表达高密度及高亲和力VIPR，为实现肿瘤放射性核素标记VIPR显像及靶向治疗提供了分子基础。新的VIPR放射性配体的研发极大地推动了肿瘤VIPR显像及治疗的研究，有望在肿瘤的早期诊断、分期及靶向治疗中发挥重要作用。Abstract: Vasoactive intestinal peptide(VIP)is a peptide hormone containing 28 amino acid residues, and it belongs to glucagon-secretin family.VIP regulates the proliferation and differentiation of normal and cancer cell through the mediation of vasoactive intestinal peptide receptor(VIPR).Different types of cancer cell membrane express distinct density and affinity of VIPR, which provides the underlying molecular basis for labeling VIPR for radionuclide imaging and targeted therapy.The progress of VIPR radioligand research greatly promotes tumor VIPR imaging and therapy.The research will play an important part in the early diagnosis, staging, and targeted therapy of cancer.
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