寡核苷酸是指含有不足20个核苷酸单体的小分子多核苷酸。自1978年Stephenson和Zamecnik^[1]报道在培养细胞中的寡核苷酸能抑制Rous肉瘤病毒的复制之后, 关于反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)类的研究大量涌现。

未经修饰的ASODN极易降解, 研究者们针对其内碱基、核糖和磷酸二酯键进行了化学修饰, 以改善其生物性能。其中, 硫代修饰ASODN是最具代表性、研究最透彻的第一代ASODN。核酸酶作用靶点的磷酸二酯键中磷原子被硫原子取代后, 对核酸酶的抗性大大提高, 但与阴离子结合蛋白的结合能力也提高, 潜在的不良作用也大大增加^[2]。第二代为混合骨架型反义寡核苷酸(mixed-backbone antisense oligonucleotides, MBOs), 它在硫代修饰ASODN基础上, 对核糖的2'-羟基进行修饰, 2'-O-甲基、2'-O-乙基是其中两个代表。这样的ASODN减少了自带的负电荷, 减少了不良反应, 提高了特异性靶向亲和力, 保留了激活核糖核酸酶H的能力及核酶抗性^[3]。肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)是研究得最早、最深入的第三代ASODN, 它是用N-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架代替戊糖磷酸骨架, 碱基通过亚甲基羰基与类肽链骨架相连, 形成与DNA分子类似的结构。PNA通过Waston-Crick氢键可以与单链DNA和RNA分子杂交, 形成双螺旋结构, 它不易被蛋白酶和核酸酶降解, 具有极强的特异性和热稳定性, 但细胞通透性较低^[4]。吗啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonuc leotides, MORF)是一种不带电荷的DNA类似物, 它以吗啉环作为骨架, 将4种碱基按所需序列合成到骨架上。它与mRNA互补序列结合后, 能抑制蛋白质的翻译, 影响mRNA的剪接, 阻碍mRNA的成熟, 妨碍其他生物大分子与RNA相互作用。MORF具有杂交高效性、高特异性、抗核酸酶降解、血浆蛋白结合率低、极好水溶性等特点, 但未修饰的MORF不易通过质膜^[5]。

在正义RNA阻断基因表达的实验中, 起作用的是一种双链的小RNA, 它对基因表达的阻断抑制作用称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)。siRNA能引起同源mRNA降解, 达到基因干扰的目的。此外, 在真核细胞核内, siRNA还可以引起同源基因DNA甲基化、染色质重构和异染色质化, 从而沉默靶基因。

虽然siRNA为研究人员提供了方便、特异的手段来了解基因的生物学功能, 但是它若作为临床用药依然存在一些障碍, 如siRNA在体内易被肾脏清除和酶降解、细胞摄取低、产生炎性因子、干扰素反应和脱靶效应等^[6]。

Felsenfeld等^[7]于1957年研究发现, 两条Poly U链与一条Poly A链可以形成一个三螺旋结构, 从而拉开了TFO研究的序幕。TFO与DNA双链中的富含嘌呤碱基链同向或反向结合后, 形成了Hoogsteen氢键或反Hoogsteen氢键, 这2种键与Watson-Crick氢键、碱基堆积力共同维系着三螺旋结构。TFO可特异性识别靶位点, 携带核酸切割因子后可以定点切割DNA。缠绕于DNA分子深沟内的TFO, 阻碍靶基因与核酸聚合酶、转录因子等结合, 从而抑制基因的表达和转录, 还可以诱导基因特异性的突变和重组^[8-9]。

目前, 对TFO的研究较多集中于病毒感染和肿瘤方面。然而TFO对核酶不稳定, 不易透过质膜, 生理pH值和离子浓度影响其稳定性及对靶基因的亲和力, 尤其对靶序列富嘌呤或富嘧啶的特殊序列要求, 限制了其广泛应用。

核苷酸本身含有S、P、H等元素, 所以³⁵S、³²P、³H是最早用于标记核苷酸的放射性核素。它们大多通过带有放射性核素的单体连接上寡聚物来标记, 也可以在核酸及其类似物合成后进行放射性核素的直接交换或化学修饰来标记。

³H-脱氧胸苷(³H-thymidine deoxyribose, ³H-TdR)作为DNA合成的前体物被体外培养细胞摄取, 参加细胞DNA的合成, 对细胞影响小, 多用于细胞转化、分裂、增殖的研究。³⁵S的射线能量低, 不适合核酸及其类似物的示踪研究。³²P标记的核酸已成为基因工程研究中不可缺少的标记物, 目前已有³²P标记核酸的试剂盒出售。

发射俄歇电子的¹²⁵I-脱氧尿苷(¹²⁵I-uridine deoxyribose, ¹²⁵I-UdR)可以作为原料参与DNA的合成。掺入细胞DNA的¹²⁵I-UdR具有显著的细胞毒性, 研究认为, ¹²⁵I-UdR衰变点附近发生的双链断裂和衰变时电离产生的自由基是引起细胞死亡的主要原因^[10]。20世纪90年代开始, ¹²⁵I-UdR已试用于人体肿瘤临床治疗, 并取得一定疗效。

在pH4.7的条件下加热, Na¹²⁵I可以被三氯化铊氧化生成碘原子, ¹²⁵I和嘧啶环上第5位C原子形成稳定的共价键。这种核酸的碘直接标记法简便、反应温和、不影响核酸生物活性, 产品比活度也高。但是三氯化铊为剧毒物, 不适合生物体内研究, 而且国家管理严格, 不易获得, 故这种标记方法一直未广泛开展。

1995年, Cammilleri等^[11]报道, 在与肿瘤发生密切相关的转化生长因子α的mRNA的ASODN 5'端连接酪胺, 并用氯胺-T法进行¹²⁵I标记, 标记后的ASODN能在肿瘤部位特异性聚集, 提示了反义显像的可行性。沈晶等^[12]用相同方法标记B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链框架区mRNA的ASODN后, 得到相似结论。Shi等^[13]报道, 在PNA氨基端连接生物素, 近羧基端的酪氨酸残基标记¹²⁵I, 生物素化的PNA与链亲和素(streptavidin, SA)和小鼠转铁蛋白受体的抗体OX26耦联, 由于血脑屏障具有高浓度转铁蛋白受体, 能够使连接SA-OX26的PNA进入脑, 而且较游离的PNA高28倍; 由于PNA与SA-OX26的链接不改变PNA的生物活性, 提示可通过多肽药物转运载体, 因此PNA有成为神经系统药物的可能。研究表明, ¹²⁵I-PNA在亨廷顿病转基因小鼠脑内较普通小鼠高出3倍, 与亨廷顿病转基因小鼠mRNA选择性表达相一致^[14]。这一结果支持了反义药物能定量体内基因表达的假说。我国学者认为, 在PNA上标记¹²⁵I, 能协同¹²⁵I的“分子刀作用”, 增强PNA对靶基因的抑制效率, 抑制增殖、促进凋亡^[15]。

关于放射性碘标记siRNA并研究其药代动力学性质的报道不多见。Braasch等^[16]合成了两种siRNA: 一种siRNA的两条链均为磷酸二酯键; 另一种siRNA的一条链为硫代修饰RNA链, 另一条为未修饰RNA链。siRNA正义链的3'端连接7个C原子间臂的伯胺, 通过合成仪连接上酪氨酸残基, 酪氨酸残基的放射性碘标记用传统的Iodogen法, 然后与互补链退火形成双链。实验中发现, 硫代修饰的RNA链会发生无效碘化反应, 这可能是因为相对于O原子, I与S原子的相互作用更强; ¹²⁵I-/¹²³I-siRNA的小鼠生物学分布与单链寡核苷酸及其他未与递药系统结合的裸siRNA的生物学分布相似, 而且给药途径和硫代修饰均不影响其生物学分布。

Panyutin等^[17]运用“Radioprinting”方法研究了TFO在细胞内外稳定性及生物学分布: 带有¹²⁵I的脱氧三磷酸胞苷通过DNA合成仪渗入到TFO的特定部位, ¹²⁵I衰变产生的俄歇电子会引起DNA双链的断裂, 通过质粒靶序列的双链断裂数来监测三螺旋复合物形成数, 结果: TFO与质粒靶序列形成三螺旋复合物后, 在体外实验中相当稳定; 通过标记的TFO探针能有效的、非侵袭性的研究难标记的质粒DNA在体内的生物学分布, 且非特异性放射性损伤低。吕中伟等^[18]报道, 以乙型肝炎病毒的前S基因为靶点合成TFO, 并标记¹²⁵I, 得到的¹²⁵ITFO较未标记的TFO可更有效的抑制细胞生长, 说明¹²⁵I-TFO具有反基因治疗和放射性内照射治疗的协同治疗效果。

⁹⁹Tc^m的标记分为直接标记法和间接标记法两种, 由于直接标记法的标记结合不牢固, 且受标记物结构限制, 故不如间接标记法使用广泛。20世纪90年代, 人们便开始了⁹⁹Tc^m标记寡核苷酸的方法学研究。二亚乙基三胺五乙酸(diethylene triamine penlaacetic acid, DTPA)和联肼尼克酰胺(hydrazino nicotinamide)均能成功的将⁹⁹Tc^m标记于寡核苷酸上, 但是联肼尼克酰胺会引起与血浆蛋白的结合, 影响寡核苷酸自身的生物学分布行为。Zhang等^[19]报道, 以N-羟基琥珀酰亚胺-巯基乙酰基三甘氨酸(N-hydroxysuccinimidyl S-acetyl-mercaptoacetyl triglycine, NHS-MAG₃)作为螯合剂标记ASODN后, ASODN杂交活性不发生改变, 解链温度也无明显变化。Nakamura等^[20]以MAG₃为螯合剂, 将⁹⁹Tc^m标记于多药耐药基因mRNA的正义寡核苷酸和ASODN上, 给瘤内注射后发现, 小鼠多药耐药基因高表达的肿瘤内ASODN的聚集明显较正义寡核苷酸高(14.7%∶8.5%), 而多药耐药基因低表达的肿瘤内正义寡核苷酸、ASODN分布未见明显差异。

最初用⁹⁹Tc^m标记MORF时, 产物中放射性酒石酸和放射性MAG₃明显。改进后的⁹⁹Tc^m标记MORF过程中, 经生物胶P4纯化后的产物调节pH值至7.6, 沸水浴加热20 min, 这样可以有效减少放射性酒石酸的生成; 同时在这种环境中, MAG₃和MORF之间的弱共轭连接极易分离, 再次生物胶P4柱纯化后, 放射性MAG₃完全清除, 结果: ⁹⁹Tc^m的标记率可达90%以上, 比活度达259 MBq/μg, 避免了标记后的纯化^[21]。有人将⁹⁹Tc^m标记的MORF用于移植瘤小鼠体内“预定位”研究: 将抗肿瘤特异性抗原的抗体与MORF连接, 在移植瘤小鼠体内预定位, 与预定位MORF序列互补的标记有⁹⁹Tc^m的cMORF(compementary MORF)静脉给药后成像, 结果: 预定位显像除了肾和肿瘤, 其他组织的放射活性水平都不高, 较传统显像技术提高了靶/非靶组织比, 靶组织更早显影, 且二价MORF较一价MORF有更强的预定位亲和力^[22]。

最近, Gasser等^[23]研究出了一种新的用于⁹⁹Tc^m标记的双功能螯合剂——Dpa-N₃(2-azido-N, N-bis[(pyridin-2-yl)methyl]ethanamine), 它合成步骤简单, 与PNA连接后用⁹⁹Tc^m标记, 得到的标记物具有很好的水溶性, 在动物体内显示快速的血浆清除率、适度的肾积聚和高稳定性。在恶性肿瘤中, 癌基因会过度表达, 运用相应探针可以早期发现肿瘤、早期治疗, 降低病死率。Wang等^[24]通过构建PNA探针, 它包括带放射性金属离子的螯合剂、PNA、胰岛素样生长因子1的环化肽类似物D (Cys-Ser-Lys-Cys), 证明了PNA探针早期诊断肿瘤的可行性。

基于之前通过肼基联氨基烟酰胺(hydrazine amino nicotinamide, HYNIC)成功标记DNA的方法, Liu等^[25]将NHS-HYNIC与siRNA的一条连有伯胺基团的单链反应, 进行⁹⁹Tc^m标记, 结果: 标记后的siRNA能高效进入细胞——每个细胞高达3×10⁵个分子, 这远高于其他文献报道。Merkel等^[26]用p-SCN-Bn-DTPA(2-(4-isothiocyanatobenzyl)diethylenetriaminepentaacetic acid)作为螯合剂, 与两条链均修饰有伯胺的siRNA反应, 因此得到比活度为99 MBq/μmol的⁹⁹Tc^m-siRNA终产物, 在比较了未与递药系统结合的裸⁹⁹Tc^m-siRNA和与支链聚亚乙基亚胺结合的⁹⁹Tc^m-siRNA在小鼠体内的代谢动力学特点后他们认为, 与siRNA结合的聚合体(或者递药系统)对其动力学和生物学分布有重要意义。近期, Kang等^[27]用NHS-MAG₃也成功标记了siRNA, 得到标记率 < 73%、放化纯 > 92%、比活度为25.9 GBq/μmol的产物。

⁹⁹Tc^m标记TFO的研究不多, 同样, ⁹⁹Tc^m标记的TFO与DNA相应双链特异性结合后也能产生双链断裂, 在体外抑制人相应基因的复制^[28]。

2-溴-N-3-(2-¹⁸F-氟吡啶-3-氧)丙基乙酰胺是在N-(4-¹⁸F-氟苄基)-2-溴乙酰胺基础上的改进, 改进后的¹⁸F标记物能方便、有效地与带有硫代磷酸酯的寡核苷酸连接, 标记过程需要140~160min^[29]。Vile等^[30]通过2-溴-N-3-(2-¹⁸F-氟吡啶-3-氧)丙基乙酰胺将¹⁸F连接于3'端硫代磷酸酯修饰的siRNA的一条单链寡核苷酸上, 再与互补链退火, 并用化学修饰后的siRNA做了PET实验, 认为在啮齿动物体内不同化学修饰的siRNA具有相似的生物学分布, 其中双链氟代修饰的siRNA具有更好的稳定性和更长的血液循环时间。

能与伯胺反应形成稳定的酰胺键的琥珀酰亚胺-4-¹⁸F-氟苯甲酸酯被用于标记伯胺修饰的siRNA, 此方法避免了退火, 缩短了¹⁸F-siRNA的制备时间, 可得到比活度为25.5 GBq/μmol的终产物; 未与递药系统结合的裸¹⁸F-siRNA的生物学分布与之前的报道相同, 然而不同于之前研究, 阳离子脂质体包裹的¹⁸F-siRNA经静脉注射后, 肺组织出现大量放射性聚集, 与³H标记的脂质体生物分布相似, 这是因为阳离子脂质体在血清中会发生聚集而瘀滞在肺毛细血管内^[31]。

尽管每种核酸及其类似物都存在各自的不足和缺陷, 放射性核素标记后的显像也存在无法区分游离核素、降解产物和完整标记物, 二维显像不能在同一投影平面准确区分各个器官的缺点, 但是其在靶向定位、定量体内基因表达、疾病诊断、基因与内照射协同治疗、基因药物开发等方面依然具有广阔前景。