-
人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, Rb)94基因是目前公认的与人类肿瘤较为密切的抑癌基因, 它在细胞周期调控、抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤治疗等方面起着重要作用。研究发现腺病毒介导的Rb94基因转染头颈部癌、膀胱癌、前列腺癌细胞系及体内肿瘤后, 具有明显的肿瘤抑制效应[1-3]。基因治疗联合放疗逐渐成为肿瘤治疗的一种新策略。本研究通过腺病毒介导, 将人Rb94基因转染到人食管癌EC109细胞中, 联合γ射线照射进行体外培养观察, 探讨Rb94基因联合γ射线照射的抑瘤作用。
-
人食管癌EC109细胞系由天津医科大学总医院惠赠, 将其加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中, 放置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。EC109细胞为贴壁生长的细胞, 每2~3 d传代一次, 本研究所用为对数生长期的EC109细胞。
-
RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京) 有限公司, 胎牛血清及胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司, β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体(an adenovirus vector containing βgalactosidase gene, Ad-lacZ)和Rb94基因重组腺病毒载体(an adenovirus vector containing Rb94 gene, Ad-Rb94)均由本实验室构建并保存, 137Cs γ射线照射源购自加拿大Nordion公司, 剂量率为0.75 Gy/ min, 酶标仪购自美国Thermo公司。
-
采用数字随机表法将培养细胞分为空白对照组(不做任何处理)、Ad-LacZ对照组(转染含lacZ基因但不含Rb94基因的腺病毒载体)、Ad-Rb94组、γ射线照射组(4 Gy 137Csγ射线照射) 和Ad-Rb94联合γ射线照射组(转染Ad-Rb94后进行4 Gy γ射线照射, 以下简称“联合组”)。
-
取对数生长期的EC109细胞, 按每孔3×103个细胞接种于96孔板中, 转染当日按上述分组处理, 包括空白对照组、Ad-LacZ对照组和Ad-Rb94组3组, 每组6个复孔, 空白对照组每孔加100 μ l RPMI 1640培养基, Ad-LacZ对照组每孔加100 μl Ad-LacZ稀释液(滴度为10×1010PFU/ml), Ad-Rb94组每孔加100 μl Ad-Rb94稀释液(滴度为10×1010PFU/ml)。每组分别于转染后培养24 h、48 h和72 h, 加入20 μl 0.5%噻唑蓝液, 孵育4 h后用酶标仪测定492 nm下的吸光度(A492)值, 按下列公式计算细胞生长的抑制率: 抑制率(%)=(1-实验组A492值/空白对照组A492值)×100%。
-
接种对数生长期的EC109细胞于96孔板中, 按1.3节中所述的分组, 转染时空白对照组、Ad-LacZ对照组和Ad-Rb94组的处理方法同1.4节中的方法, 在γ射线照射组中每孔加100 μl RPMI 1640培养基, 联合组中每孔加100 μl Ad-Rb94稀释液(滴度为10×1010PFU/ml)。培养6 h后对γ射线照射组和联合组进行4 Gy γ射线照射, 24 h后通过噻唑蓝法测各组A492值并比较各组对EC109细胞生长的抑制率。
-
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析, 组间比较采用单因素方差分析及χ2检验, P < 0.05表示差异有统计学意义。
-
转染后不同时间各组对EC109细胞的抑制率见表 1, 其中, Ad-Rb94组与Ad-lacZ组在转染24 h、48 h和72 h后对EC109细胞的抑制率比较, 差异有统计学意义(F分别为42.9、54.6和37.9, P均 < 0.05)。Ad-lacZ组与空白对照组比较差异无统计学意义(F分别为6.03、5.66和7.14, P均 < 0.05)。对EC109细胞的抑制率以转染后24 h为最高, 24 h的抑制率与48 h和72 h的抑制率相比, 差异有统计学意义(F=15.7, P < 0.05), 而48 h和72 h的抑制率差异无统计学意义(F=2.54, P > 0.05)。
24 h 48 h 72 h 空白对照组 0 0 0 Ad-lacZ对照组 3.9 ± 0.4 2.4 ± 1.4 4.3 ± 1.9 Ad-Rb94组 18.3 ± 0.4 14.3 ± 1.9 13.2 ± 1.7 注: 表中, Ad-lacZ: β -半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体; Ad-Rb94:Rb94基因重组腺病毒载体。 表 1 Ad-lacZ和Ad-Rb94转染后不同时间对EC109细胞生长的抑制率[%, (x±s)]
-
联合组对EC109细胞生长的抑制率最高(40.30%±4.2%), 与Ad-Rb94组(18.3%±0.4%)和γ射线照射组(27.40%±2.9%)相比, 差异具有统计学意义(χ2=7.91和χ2=5.82, P均 < 0.05), γ射线照射组与Ad-Rb94组相比, 差异具有统计学意义(χ2=5.12, P < 0.05)。结果提示, Rb94基因对EC109细胞的生长具有抑制作用, Rb94基因与γ射线联合应用具有协同效应, 抑制细胞生长的作用更强(图 1)。
图 1 不同组别对EC109细胞生长的抑制率[%, (x±s)]
-
基因治疗联合放疗是最新生物治疗技术与传统治疗方式相结合的产物。放疗使受照细胞表面受损及穿孔, 引起细胞膜通透性和跨膜电位的改变, 便于带负电荷的外源基因主动进入细胞, 提高了基因转移的效率, 基因治疗联合放疗对肿瘤的抑制具有协同作用。
为了确定腺病毒载体上基因的作用, 本研究以Ad-lacZ作为对照, 结果发现, Ad-lacZ本身对食管癌EC109细胞的生长没有抑制作用, 表明对肿瘤细胞的抑制作用来自转导的人Rb94基因, 而不是复制缺陷病毒(腺病毒)载体本身。
本研究中Ad-Rb94转染EC109细胞后的不同时间内, 24 h的抑制率高于48 h和72 h的抑制率, 可能与没有给予细胞换液、培养基中的营养物质减少而导致细胞生长减慢有关。Ad-Rb94组、γ射线照射组和联合组对EC109细胞生长均具有抑制作用, 其中联合组的抑制率最强, 明显高于Ad-Rb94组和γ射线照射组。结果表明, 人Rb94基因能增强细胞对γ射线的敏感性, 两者联合应用具有相加和协同效应, 与文献结果一致[4-6], 能有效地抑制肿瘤细胞的异常增生。本研究为食管癌的基因治疗联合放疗研究以及可能的临床应用提供了理论基础和实验依据。
Ad-Rb94联合γ射线照射对食管癌细胞生长的影响
Effects of recombinant adenovirus mediated retinoblastoma gene 94 combined with γray on growth of esophageal carcinoma cells
-
摘要:
目的 探讨人视网膜母细胞瘤94基因重组腺病毒载体（Ad-Rb94）联合γ射线对人食管癌细胞体外生长的抑制作用。 方法 采用随机数字表法将培养细胞分为空白对照组、β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体（Ad-LacZ）对照组、Ad-Rb94组、γ射线照射组和Ad-Rb94联合γ射线照射组（联合组），Ad-LacZ和Ad-Rb94于体外转染人食管癌EC109细胞系，转染6 h后进行4 Gy 137Cs γ射线照射，用噻唑蓝法检测细胞的生长抑制率。 结果 Ad-Rb94组、γ射线照射组和联合组对EC109细胞生长均具有抑制作用，其中，联合组抑制率最高（40.30±4.2）%，明显高于Ad-Rb94组（18.3±0.4）%和γ射线照射组(27.40±2.9)%（χ2=7.91, χ2=5.82，P < 0.05）；γ射线照射组与Ad-Rb94组比较差异具有统计学意义（χ2=5.12, P < 0.05）。 结论 Ad-Rb94联合γ射线照射对食管癌细胞的抑瘤作用具有协同效应，能有效地抑制肿瘤细胞的生长。 -
关键词:
- 基因, 视网膜母细胞瘤94 /
- 食管肿瘤 /
- 基因疗法 /
- 放射疗法
Abstract:Objective To study the combined effect of exogenous recombinant adenovirus-mediated retinoblastoma gene 94(Ad-Rb94)combined with γ-ray on the growth of esophageal carcinoma cells. Methods Cell culture were randomly divided into 5 groups: control group, recombinant adenovirus vector containing βgalactosidase gene(Ad-LacZ)group, Ad-Rb94 group, γ-ray radiation group and Ad-Rb94 combined with γray radiation group.EC109 cells were transfected by Ad-Rb94 and exposed to 4 Gy 137Cs γ-ray irradiation 6 hours after transfection.The inhibition rate of EC109 cells were detected by MTT assay. Results EC109 cellstransfected with Ad-Rb94 group, γ-ray radiation group and Ad-Rb94 combined with γ-ray radiation group were all inhibited.The inhibition rate of Ad-Rb94 combined with γ-ray radiation group reached(40.30%±4.2%), significantly higher than Ad-Rb94 group(18.3%±0.4%)and γ-ray radiation group(27.40%±2.9%)(χ2=7.91, χ2= 5.82, P < 0.05).The difference of inhibition rate between γ-ray radiation group and Ad-Rb94 group was extremely significant(χ2=5.12, P < 0.05). Conclusion The recombinant Ad-Rb94 gene transfection combined with γ-ray shows the synergism forthe inhibition of the growth of EC109 cells. -
Key words:
- Genes, retinoblastoma 94 /
- Esophageal neoplasms /
- Gene therapy /
- Radiotherapy
-
表 1 Ad-lacZ和Ad-Rb94转染后不同时间对EC109细胞生长的抑制率[%, (x±s)]
24 h 48 h 72 h 空白对照组 0 0 0 Ad-lacZ对照组 3.9 ± 0.4 2.4 ± 1.4 4.3 ± 1.9 Ad-Rb94组 18.3 ± 0.4 14.3 ± 1.9 13.2 ± 1.7 注: 表中, Ad-lacZ: β -半乳糖苷酶基因重组腺病毒载体; Ad-Rb94:Rb94基因重组腺病毒载体。 
下载: 导出CSV
-
[1] Li D, Day KV, Yu S, et al. The role of adenovirus-mediated retinoblastoma 94 in the treatment of head and neck cancer. Cancer Res, 2002, 62(16): 4637-4644. [2] Zhang X, Multani AS, Zhou JH, et al. Adenoviral-mediated retinoblastoma 94 produces rapid telomere erosion, chromosomal crisis, and caspase-dependent apoptosis in bladder cancer and immortalized human urothelial cells but not in normal urothelial cells. Cancer Res, 2003, 63(4): 760-765. [3] Roig JM, Molina MA, Cascante A, et al. Adenovirus-mediated retinoblastoma 94 gene transfer induces human pancreatic tumor regression in a mouse xenograft model. Clin Cancer Res, 2004, 10(4): 1454-1462. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-0442-03 [4] 张克君, 李德春, 朱东明, 等. 重组腺病毒mIκBα基因联合γ射线治疗肝细胞癌的实验观察. 中华放射医学与防护杂志, 2007, 10(27): 454-457.
[5] 张耀文, 王芹, 李进, 等. 重组腺病毒Ad-Rb94基因联合放疗对人肝癌细胞生长的抑制作用. 中国辐射卫生, 2008, 17(2): 147-148. doi: 10.3969/j.issn.1004-714X.2008.02.008
[6] 王蕾, 李进, 姜恩海, 等. 人Rb94基因联合γ射线照射对K150细胞生长影响的体外研究. 中华放射医学与防护杂志, 2009, 29(6): 568-570. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2009.06.003
-
点击查看大图
图(1)表(1)
计量
- 文章访问数: 1850
- HTML全文浏览量: 587
- PDF下载量: 3