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五鹤续断(Wu-He Dipsacus asper, WHDA)属川续断科, 是多年生草本植物, 药用部位为其干燥根, 主产地为湖北省鹤峰县、五峰县, 其资源丰富, 品质优良[1]。WHDA作为中药原材料, 具有补肝益肾、续接筋骨、抗骨质疏松等功效[2]。相关研究表明, WHDA还具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用, 而且几乎没有毒性[3]。目前, 有关WHDA对辐射损伤组织的保护作用方面的报道较为少见, 为此, 我们通过研究其对小鼠辐射损伤的影响, 为进一步利用WHDA防护辐射损伤提供科学依据。
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昆明种雌性小鼠, 6~8周龄, 体质量为(20±2)g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供, 常规饲养。
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超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二酰二醛(malonyldialdehyde, MDA)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。WHDA注射液由恩施州中药材生产质量管理规范示范基地提供, 采用水提醇沉淀法制成含生药3%的注射液, 瓶装密封、消毒备用。
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日本Sysmex-820自动血细胞计数仪, GL-20GII型高速低温离心机(上海优浦科学仪器有限公司), 日本岛津UV-2450分光光度仪, 水浴箱(北京市医疗设备厂)。
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实验分4组, 包括正常对照组、照射组、低剂量WHDA(40 mg·kg-1·d-1)+照射组和高剂量WHDA (200 mg·kg-1·d-1)+照射组。小鼠常规饲养数日后, 给药组小鼠每日腹腔注射WHDA注射液, 正常对照组和照射组注射等量生理盐水, 连续给药7 d。照射组用60Co源γ射线全身一次性照射6 Gy, 剂量率为0.2 Gy/min, 源皮距为80 cm。
小鼠状态及存活率的测定: 每组取20只小鼠, 照射后每日观察一次, 连续30 d, 记录小鼠状态和死亡数量。
外周血象测定: 各实验组于照射后6 h、3 d、6 d、9 d时分别取5只小鼠(每组20只), 由尾静脉取血25 μl, 用自动血细胞计数仪检测外周血象。
小鼠体质量、各脏器质量的测定: 小鼠称重后采取颈椎脱臼处死, 分别取胸腺、脾脏和肝脏称重, 计算其质量。
外周血和肝脏的SOD、GSH、MDA水平测定: 小鼠眼眶取血1.2 ml, 颈椎脱臼处死后取肝脏, 严格按试剂盒方法进行检测。
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本研究中所有计数均以均数±标准差(x±s)表示, 使用SPSS11.5软件对数据进行统计学分析处理, 采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的统计方法, 组间两两比较使用最小显著差数法检验, 以α=0.05为检验水准, P < 0.05表示差异有统计学意义。
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6 Gy照射后小鼠体质量减轻、皮毛干枯、精神萎靡、行动迟缓、团缩拱背、视力障碍; WHDA注射组小鼠的上述体征均有所改善(体质量除外)。
WHDA可提高6 Gy照射后小鼠的30 d存活率, 其中, 单纯照射组小鼠的存活率为60%, 平均存活时间为22.5 d, 低剂量给药+照射组存活率为90%, 平均存活时间为28.8 d, 高剂量给药+照射组存活率为80%, 平均存活时间为26.5 d(表 1)。
组别 鼠数 存活数 存活率
(%)平均存
活时间(d)正常对照组 20 20 100 30.0 照射组 20 12 60 22.5 低剂量WHDA+照射组 20 18 90 28.8 高剂量WHDA+照射组 20 16 80 26.5 注: WHDA为五鹤续断。 表 1 WHDA对6 Gy照射小鼠30 d存活率的影响
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辐射后10 d内小鼠的外周血白细胞和血小板数量明显减少(α=0.05, P < 0.01), 红细胞和血红蛋白数量减少不明显。WHDA对辐射损伤小鼠的外周血白细胞及血小板数量的影响见表 2, WHDA组在受照后6 h、第3 d和第6 d时外周血白细胞总数显著高于照射组(α=0.05, P < 0.01);受照后3 d、6 d和9 d时外周血血小板数量显著高于照射组(α=0.05, P < 0.01)。
组别 鼠败 白细胞数 血小板数 6h 3d 6d 9d 6h 3d 6d 9d 正常对照组 5 14.24 ± 1.11 12.78 ±0.75 11.42 ±0.58 14.41 ± 1.23 1060.20 ±36.45 1066.21 ±33.12 1223.11 ±23.98 1175.78 ±13.23 照射组 5 11.34 ±0.48 1.46±0.10 1.19 ±0.08 0.88 ±0.81 1220.78 ±13.78 811.32±41.09 66.09 ± 11.88 16.78 ±3.34 低剂置WHDA+照射组 5 14.44 ±U8 2.5210.08 1.65 ±0.21 1.07 ±0.08 1137.46 ±67.86 1087.30 ±37.45 174.12 ±13.01 54.56 ±6.98 髙剂MWHDA+照射组 5 15.75 ±0.75 12.72 ±0.28 14.51 ±1.15 14.67 ±0.76 1180.08 ±26.54 1167.34 ±68.09 1209.11 ±53.95 1157.91 ± 12.24 注: WHDA为五鹤续断。 表 2 WHDA对6 Gy照射小鼠的外周血白细胞和血小板数的影响
（×109/L） -
照射后小鼠体质量明显降低, WHDA对受照射小鼠胸腺、脾脏、肝脏质量均无明显影响(表 3)。
组别 鼠数 体质量(g) 胸腺质量(g) 脾脏质量(g) 肝脏质量(g) 1d 4d 1d 4d 1d 4d 1d 4d 正常对照组 5 18.42 ± 0.4 18.64 ± 0.5 0.065 ± 0.006 0.056 ± 0.0D4 0.074 ± 0.007 0.123 ± 0.003 1.056 ± 0.057 1.198 ± 0.002 照射组 5 16.02 ± 0.4 12.78 ± 0.3 0.019 ± 0.002 0.089 ± 0.001 0.045 ± 0.002 0.015 ± 0.003 1.089 ± 0.049 0.625 ± 0.007 低剂量WHDA+照射组 5 16.04 ± 0.3 13.35 ± 0.4 0.018 ± 0.001 0.005 ± 0.002 0.041 ± 0.002 0.017 ± 0.002 0.981 ± 0.124 0.628 ± 0.002 高剂屋WHDA+照射组 5 19.04 ± 0.5 18.90 ± 0.5 0.049 ± 0.004 0.037 ± 0.001 0.062 ± 0.004 0.193 ± 0.001 1.012 ± 0.032 1.012 ± 0.032 注: 表中，WHDA: 五鹤续断。 表 3 WHDA对6 Gy照射小鼠几种脏器质量的比较
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受照后小鼠血液中SOD活性显著降低, MDA含量增高, WHDA能显著提高血液中SOD活性, 降低MDA含量; 受照后小鼠肝脏中SOD、GSH活性显著降低, MDA含量显著增高, WHDA能显著提高肝脏中SOD活性, 增加GSH含量, 降低MDA含量(表 4, 5)。
组别 鼠数 S0D(U/ml) GSH(mg/ml) MDA(nmoI/ml) 正常对照组 5 362.36 ± 11.28 30.21 ± 1.24 3.38 ±0.55 照射组 5 176.45 ± 17.35 30.62 ± 1.70 6.25 ± 0.61 低剂最WHDA+照射组 5 323.76 ± 13.56 31.76 ± 1.21 5.68 ± 0.68 高剂量WHDA+照射组 5 341.45 ± 20.32 33/78 ± 1.56 4.68 ± 0.74 注: 表中，SOD: 超氧化物歧化酶; CSH: 谷胱甘肽; MDA: 丙二酰二醛; WHDA: 五鹤续断。 表 4 WHDA对6 Gy照射小鼠外周血中SOD、GSH、MDA水平的比较
组别 鼠数 SOD(U/mgprot) GSH(mg/gprot) MDA(nmol/mgprot) 正常对照组 5 214.36 ± 7.78 42.09 ± 115 1.78 ± 0.15 照射组 5 185.47 ± 9.75 30.62 ± 2.30 945 ± 0, 82 低剂量WHDA+照射组 5 205.76 ± 13.80 44.16 ± 2.81 6.86 ± 0.76 高剂量WHDA+照射组 5 212.74 ± 14.68 43.42 ± 3.01 6.90 ± 0, 91 注: 表中，SOD: 超氧化物歧化酶; CSH: 谷胱甘肽; MDA: 丙二酰二醛; WHDA: 五鹤续断。 表 5 WHDA对6 Gy照射小鼠肝脏中SOD、GSH、MDA的含量比较
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辐射损伤的生物效应首先包括直接损伤或正常代谢产生的自由基和活性酶与辐射产生的活泼基团反应、DNA和RNA损伤, 酶的激活和灭活、脂质过氧化、细胞内疏基含量下降、正常生化反应受到干扰(如DNA修复), 然后包括由射线引起次级反应如细胞周期延迟、能量供应紊乱、许多重要生化反应被干扰及生物膜被破坏等。由此可见, 在照射前对生物机体补充外源性的自由基清除剂或抗氧化剂, 可在辐射效应早期有效地消除自由基, 减少辐射对细胞的氧化损伤。另外, 在正常生理条件下, 需氧生物体由氧代谢产物及其衍生的含氧物质在体内不断地产生自由基, 称为内源性自由基, 这种自由基是维持生命所必需的, 但过多的自由基会成为生物大分子、细胞和生物组织的损害因子。在生物体内存在一套清除自由基的抗氧化系统, 它由SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等酶系统和抗坏血酸、β-胡萝卜素、维生素A、维生素E等非酶系统组成。内源性自由基在体内不断地产生, 也不断地被清除, 处于平衡状态之中, 并保持在极低的生理浓度下。辐射使活性氧的产生与清除失去平衡, 自由基异常增多, 导致脂质过氧化作用增强, 最终使脂过氧化物在体内大量堆积, 同时也使得SOD和维生素E、β-胡萝卜素消耗增加, 并表现出其活性或含量下降, 因此增加抗氧化酶的活性可以提高辐射抗性[4-7]。本研究显示, WHDA有很好的清除自由基的能力, 能提高受照射小鼠血液和肝脏中SOD的活性, 降低MDA水平, 增加肝脏中GSH水平, 可见WHDA的抗氧化作用是其抗辐射作用的重要机制。
由于造血干细胞具有很高的辐射敏感性, 受照射后其数量急剧减少, 导致外周血中成熟血细胞来源匾乏, 故外周血白细胞、血小板的数量均呈不同程度的降低。实验结果显示, 照射后各组小鼠的白细胞、血小板数量均明显下降, 但给药组小鼠白细胞和血小板数量下降幅度较小, 且回升趋势均较单纯照射组好。与单纯照射组相比, 给药组小鼠的白细胞、血小板数量回升情况较好, 提示WHDA对受照射小鼠的血液系统具有一定程度的辐射保护作用。
五鹤续断对辐射损伤小鼠保护作用的研究
Study on radioprotective effect of Wu-He Dipsacus asper in mice
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摘要:
目的 研究五鹤续断（WHDA）注射液对辐射损伤小鼠的保护作用。 方法 将160只昆明种雌性小鼠分为正常对照组、照射组和低剂量WHDA+照射组、高剂量WHDA+照射组，观察其30 d存活率；测定辐射后6 h、3 d、6 d、9 d小鼠的外周血象；测定辐射后小鼠的胸腺、脾脏和肝脏质量；测定辐射后小鼠外周血和肝脏的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）及丙二酰二醛（MDA）水平。 结果 WHDA可提高辐射后小鼠的存活率，对其白细胞及血小板的数量变化有显著影响，但对其胸腺、脾脏、肝脏质量均无明显影响。WHDA还能显著提高辐射后小鼠的SOD活性，增加GSH水平，降低MDA水平。 结论 WHDA对辐射损伤小鼠有明显的保护作用。 Abstract:Objective To study protective effect of Wu-He Dipsacus asper(WHDA)injection on the radiation damaged mice. Methods One hundred and twenty Kunming female mice were divided into normal control group, model control group, Wu-He Dipsacus asper treatment group to observe the 30-day survival rate; measured peripheral blood 6 hours, 3 days, 6 days and 9 days after irradiation, respectively; thymus, spleen and liver weight were detected; superoxide dismutase(SOD), glutathione(GSH), malonyldialdehyde(MDA)in liver and peripheral blood were also detected. Results WHDA can improve the survival rate of mice after radiation, and take a significant influence on white blood cells and platelets, but no obvious effect on the weight of thymus, spleen and liver.In addition, WHDA can improve SOD activity, increased GSH content and decrease MDA content significantly in this study. Conclusion WHDA has obvious protective effect in mice with radiation injury. -
Key words:
- Radiation injuries /
- Radiation protection /
- Wu-He Dipsacus asper
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表 1 WHDA对6 Gy照射小鼠30 d存活率的影响
组别 鼠数 存活数 存活率
(%)平均存
活时间(d)正常对照组 20 20 100 30.0 照射组 20 12 60 22.5 低剂量WHDA+照射组 20 18 90 28.8 高剂量WHDA+照射组 20 16 80 26.5 注: WHDA为五鹤续断。 
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表 2 WHDA对6 Gy照射小鼠的外周血白细胞和血小板数的影响
（×109/L） 组别 鼠败 白细胞数 血小板数 6h 3d 6d 9d 6h 3d 6d 9d 正常对照组 5 14.24 ± 1.11 12.78 ±0.75 11.42 ±0.58 14.41 ± 1.23 1060.20 ±36.45 1066.21 ±33.12 1223.11 ±23.98 1175.78 ±13.23 照射组 5 11.34 ±0.48 1.46±0.10 1.19 ±0.08 0.88 ±0.81 1220.78 ±13.78 811.32±41.09 66.09 ± 11.88 16.78 ±3.34 低剂置WHDA+照射组 5 14.44 ±U8 2.5210.08 1.65 ±0.21 1.07 ±0.08 1137.46 ±67.86 1087.30 ±37.45 174.12 ±13.01 54.56 ±6.98 髙剂MWHDA+照射组 5 15.75 ±0.75 12.72 ±0.28 14.51 ±1.15 14.67 ±0.76 1180.08 ±26.54 1167.34 ±68.09 1209.11 ±53.95 1157.91 ± 12.24 注: WHDA为五鹤续断。
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表 3 WHDA对6 Gy照射小鼠几种脏器质量的比较
组别 鼠数 体质量(g) 胸腺质量(g) 脾脏质量(g) 肝脏质量(g) 1d 4d 1d 4d 1d 4d 1d 4d 正常对照组 5 18.42 ± 0.4 18.64 ± 0.5 0.065 ± 0.006 0.056 ± 0.0D4 0.074 ± 0.007 0.123 ± 0.003 1.056 ± 0.057 1.198 ± 0.002 照射组 5 16.02 ± 0.4 12.78 ± 0.3 0.019 ± 0.002 0.089 ± 0.001 0.045 ± 0.002 0.015 ± 0.003 1.089 ± 0.049 0.625 ± 0.007 低剂量WHDA+照射组 5 16.04 ± 0.3 13.35 ± 0.4 0.018 ± 0.001 0.005 ± 0.002 0.041 ± 0.002 0.017 ± 0.002 0.981 ± 0.124 0.628 ± 0.002 高剂屋WHDA+照射组 5 19.04 ± 0.5 18.90 ± 0.5 0.049 ± 0.004 0.037 ± 0.001 0.062 ± 0.004 0.193 ± 0.001 1.012 ± 0.032 1.012 ± 0.032 注: 表中，WHDA: 五鹤续断。
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表 4 WHDA对6 Gy照射小鼠外周血中SOD、GSH、MDA水平的比较
组别 鼠数 S0D(U/ml) GSH(mg/ml) MDA(nmoI/ml) 正常对照组 5 362.36 ± 11.28 30.21 ± 1.24 3.38 ±0.55 照射组 5 176.45 ± 17.35 30.62 ± 1.70 6.25 ± 0.61 低剂最WHDA+照射组 5 323.76 ± 13.56 31.76 ± 1.21 5.68 ± 0.68 高剂量WHDA+照射组 5 341.45 ± 20.32 33/78 ± 1.56 4.68 ± 0.74 注: 表中，SOD: 超氧化物歧化酶; CSH: 谷胱甘肽; MDA: 丙二酰二醛; WHDA: 五鹤续断。
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表 5 WHDA对6 Gy照射小鼠肝脏中SOD、GSH、MDA的含量比较
组别 鼠数 SOD(U/mgprot) GSH(mg/gprot) MDA(nmol/mgprot) 正常对照组 5 214.36 ± 7.78 42.09 ± 115 1.78 ± 0.15 照射组 5 185.47 ± 9.75 30.62 ± 2.30 945 ± 0, 82 低剂量WHDA+照射组 5 205.76 ± 13.80 44.16 ± 2.81 6.86 ± 0.76 高剂量WHDA+照射组 5 212.74 ± 14.68 43.42 ± 3.01 6.90 ± 0, 91 注: 表中，SOD: 超氧化物歧化酶; CSH: 谷胱甘肽; MDA: 丙二酰二醛; WHDA: 五鹤续断。
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