NMDAR作为主要的离子型谷氨酸受体, 是一种受配体和膜电位双重调节的配体门控离子通道, 其有多个特殊的结合位点, 如H⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、非竞争性拮抗剂、谷氨酸、甘氨酸、多胺等结合位点(图 1)^[1], 还可发生磷酸化等修饰性改变。NMDAR的激活具有特殊性, 对Ca²⁺的通透性比Na⁺或K⁺高^[2]。NMDAR广泛分布于中枢神经系统, 但以海马和皮层最多, 其在突触传递及可塑性、学习和记忆等生理过程以及脑卒中兴奋性神经毒、神经退行性病变、精神疾病等病理过程中发挥着重要作用^[3]。

图  1  N-甲基-D-天冬氨酸受体-通道模式图

NMDAR由NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D和NR3等亚基组成, NR1是功能亚基, NR2、NR3是调节亚基, 通常由2个NR1亚基和2个NR2亚基组成异四聚体^{[1, 4]}。脑卒中缺血缺氧时, NR2A/NR2B比例表达下调, NMDAR功能发生改变^[5-6], NR2B数目越多, 神经元对神经毒的易感性越强^[7]。选择不同亚基作靶点, 可以研制有效的脑卒中治疗药物^[8]。

脑卒中时, 缺血、缺氧将造成能量代谢障碍-兴奋性神经递质谷氨酸大量释放-谷氨酸受体(以NMDAR为主)过度激活-受体-效应器耦联异常-钙电导增加-神经元内钙超载-自由基反应-细胞死亡等, 这一系列缺血性连锁反应是导致脑卒中时脑损害的中心环节, 即缺血瀑布理论^[9]。可见, 谷氨酸激活NMDAR引起的兴奋性神经毒效应在脑卒中的发生、发展中起关键作用, 脑卒中的缺血中心区即细胞水肿、坏死的梗死中心区, 缺血边缘区即半影区(或半暗带), 随着时间延长细胞可发生继发性死亡^[10]。因此, 脑卒中的治疗有时间窗限制, 对脑卒中早期诊治能最大限度的挽救半影区神经细胞, 使脑功能受损程度减到最小^[11]。

脑卒中时, 突触间隙增加的谷氨酸与突触后膜NMDAR结合, NMDAR过度激活, Ca²⁺通道打开, 胞内钙超载直接产生超氧阴离子(O^2-), Ca²⁺与钙调蛋白结合, 一方面激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS), NOS催化L-精氨酸生成一氧化氮(nitric oxide, NO), NO又迅速与分子氧、超氧阴离子及铜、铁、镁等反应生成氧自由基产物, NO还与缺血条件下的大量超氧化物反应, 生成过氧亚硝酸阴离子(ONOO^-)和羟自由基, ONOO^-可造成DNA损伤和抑制线粒体的呼吸链功能, 产生ATP功能障碍, 促进氧化级联反应, 导致细胞的氧化损伤; 另一方面激活钙神经素, 使NOS去磷酸化而进一步激活NOS, 促进产生的NO^-与O^2-结合形成ONOO^-, 加剧体内自由基大量生成。损伤的DNA激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶, 加剧能量耗竭, 最终导致神经元死亡^[3]。Ca²⁺还可激活蛋白激酶、磷脂酶A2和磷脂酶C, 兴奋多价不饱和脂肪酸, 促使过氧化物和花生四烯酸生成增多, 钙泵活性减低, ATP产生不足, 反过来又促发突触末梢兴奋性氨基酸类神经递质的大量释放, 激活突触后的NMDAR, 细胞内Ca²⁺浓度进一步持续升高, 导致神经细胞损伤甚至死亡^[12]。同时, 在缺血、缺氧条件下, 蛋白激酶C活性增加, 促进NMDAR磷酸化水平, 增加Ca²⁺内流, 后者又促进磷酸化程度^[13]。

脑卒中时, NMDAR被过度激活, 离子通道异常, Ca²⁺、Na⁺和Cl^-大量流入细胞内, K⁺外流, 使细胞内外离子失去平衡, 导致细胞水肿和神经传导异常, 而细胞内Ca²⁺释放的增加, 加剧了胞内钙的超载^[14]。胞内钙超载除有上述作用机制外, 还通过激活核酸内切酶和凋亡蛋白酶促进神经元凋亡; 通过改变线粒体功能, 导致渗透性水肿或线粒体膜电位去极化, 线粒体氧化磷酸化失耦联或释放某些凋亡调控蛋白, 最终引起细胞凋亡; 通过激活半胱氨酸蛋白酶, 降解细胞骨架蛋白, 破坏微管, 导致细胞死亡。利用Ca²⁺通道阻滞剂可以对脑卒中动物模型起到脑保护作用, 细胞内Ca²⁺螯合剂1, 2-双(O-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N', N'-四乙酸也能减轻缺血后神经元损伤^[3]。

通过形态、生化、细胞和分子生物学的研究证明, 脑卒中时神经元的死亡包括坏死和凋亡, 其中早期引起的急性期神经元死亡以坏死为主, 而晚期的继发性死亡或迟发型死亡则以凋亡为主。神经元凋亡是一个通过合成新的蛋白质来实现的主动过程, 其中参与的因子主要有capsase家族蛋白酶、Bcl-2家族蛋白、丝裂原激活的蛋白激酶家族酶蛋白、线粒体释放蛋白、细胞溶酶体释放的多种酶蛋白、细胞核因子-κB、细胞因子及抑癌基因p53等。例如, capsase家族蛋白酶激活, 进而特异性识别、水解半胱氨酸和天冬氨酸残基, 导致DNA断裂, 神经元死亡, 随着病情的发展, 免疫炎症可促进细胞凋亡^[10]。

NMDAR在脑卒中的发生、发展中起着关键作用, 因此研制特异性的NMDAR显像剂, 利用PET或SPECT研究NMDAR分布、数量和功能等的微量变化, 可对脑卒中作出早期诊断。

要成为一种理想的NMDAR显像剂, 其标记前体的选择很重要, 基于NMDAR的结构, 目前对NMDAR显像剂标记前体的研究重点是通过分析NMDAR亚基作用位点来确定, ①NR2亚基N末端区域: 作用于该区域的前体药物主要有艾芬地尔(ifenprodil)及其衍生物(主要作用于NR2B)和Zn²⁺(主要作用于NR2A)^[15]; ②通道区域, 作用于该区域的前体药物需在NMDAR激活后通道打开, 才能起作用, 为非竞争性拮抗剂, 以电压依赖的方式起作用, 其主要的代表性前体药物有苯环己哌啶(phencyclidine, PCP)、噻吩环己哌啶(thienylcyclohexylpiperidine)、氯胺酮、地卓西平(dizocilpine, MK-801)和金刚烷类的衍生物美金刚(memantine)等^[4]。不同亚基在不同疾病中所起的作用不同, 如脑卒中时以NR2B为主, 药物可作用于NR1与NR2亚单位的一种或数种, 从而有综合疗效^[16]。

常见的NMDAR的PCP位点PET和SPECT显像剂有¹⁸F-MK-801、¹¹C-氯胺酮、N-(1-萘基)-N′-(3-¹²⁵I-碘苯基)-N′-甲基胍(N-(1-naphthyl)-N′-(3-¹²⁵I-iodophenyl)-N′-methylguanidine, ¹²⁵I-CNS 1261)、¹¹CN-(2-氯-5-硫代甲烯基)-N′-(3-甲氧基-苯基)-N′-甲基胍(¹¹C-N-(2-chloro-5-thiomethylenyl)-N′-(3-methoxyphenyl)-N′-methylguanidine, ¹¹C-GMOM)等^[17]。

(1) MK-801。主要通过降低NMDAR, 对脑卒中有脑保护作用^[18]。Blin等^[19]用¹⁸F-methyl-MK-801对狒狒进行PET发现, 在缺血、缺氧条件下, ¹⁸F-methyl-MK-801在脑局部的药物动力学改变不明显, 加上体内特异性结合低, 使其体内应用受到限制。考虑其体内特异性结合效率, Wallace等^[20]用³H-MK-801定量放射自显影评价重摄取来分析大鼠大脑中动脉阻塞, 结果: 静脉给予³H-MK-801后15min, 缺血皮层和纹状体对该显像剂的聚集低于对侧大脑半球, 而60 min后则出现相反的现象, 表明早期对³HMK-801的摄取由脑血流量决定, ³H-MK-801能否作为脑卒中显像剂有待于进一步研究。将¹²³I-MK-801用于人脑出血NMDAR SPECT发现, 给予显像剂后60~120 min, 皮质区和出血邻近区显像剂滞留的增加与NMDAR的激活相一致; 尽管¹²³I-MK-801有可能作为一种SPECT显像剂来评价脑卒中时NMDAR的激活水平, 但由于其高脂溶性和由此而致的高非特异性结合, 限制了其使用^[21]。

(2) 氯胺酮。其结合于NMDAR的PCP位点, 脂溶性较高, 易透过血脑屏障发挥抗兴奋性氨基酸的毒性作用, 降低NMDA通道的开放频率及开放时间, 减少NMDAR介导的Ca²⁺内流, 降低细胞内Ca²⁺超载对神经递质释放的刺激, 抑制缺血所致的Na⁺, K⁺-ATP酶活性的降低, 抑制NOS的活性。从而加强缺血细胞内Ca²⁺浓度的调节和对递质的再摄取, 在脑卒中时应用对神经细胞产生保护作用^[22]。用¹¹C-氯胺酮PET发现, 其在脑内有较高摄取, 但在脑内代谢及清除过快, 缺乏特异性结合^[17], 使其在脑卒中的应用受到限制。

(3) ¹²⁵I-CNS1261。Owens等^[23]发现, 脑缺血大鼠对¹²⁵I-CNS 1261的摄取在NMDAR分布区域较正常鼠增加, 体外实验证明其对NMDAR的MK-801结合位点具有高亲和力, 平衡解离常数值为(4.21±0.40)×10^-9mol, 其脂水分配系数的对数(logD7.4)值为2.13, 而¹²⁵I-MK-801为3.30;¹²⁵ICNS 1261在体内代谢快, 半衰期为(2.17±0.44) min, 在给药后120 min, 脑组织匀浆仍可测到其活性 > 95%。¹²³I-CNS 1261的特异性结合较高, 提前给予MK-801后, ¹²³I-CNS1261与NMDAR的结合明显降低。在生理情况下, ¹²³I-CNS 1261呈可逆性结合, 分布总体积定量参数可信, 从大到小依次为丘脑、纹状体、皮层、白质^[24]。¹²³I-CNS 1261在临床脑卒中的应用需进一步研究。

(4) ¹¹C-GMOM。其对NMDAR的PCP位点有很高的亲和力, 脂溶性适中, 在啮齿类动物中的特异性结合为50%^[17]。Waterhouse等^[25]合成¹¹C-GMOM后分析表明, 其平衡解离常数值为(5.2±0.3)×10^-9mol, 脂水分配系数的对数为2.34, 放化纯度高达(96.7±1.5)%, 特异性活性为(1.25±0.45)×3.7 PBq/ mol; ³H-MK801的体内特性结合百分率为15%, 而¹¹C-GMOM达50%, 这可能与GMOM的低脂溶性有关; ¹¹C-GMOM在狒狒体内的特异性结合较大鼠体内低, 这说明物种差异使¹¹C-GMOM的特异性结合在啮齿类动物与灵长类有差别。该显像剂可衡量NMDAR激活时的变化, 进而通过改变谷氨酸等神经递质而提供药物治疗基础, 这与临床脑卒中的发病有密切关系, 有早期诊治潜能。

(5) 美金刚。其通过与NMDAR的PCP位点结合而阻断NMDAR通道, 从而阻断Ca²⁺内流引起的后续级联反应, 用于脑卒中后有较好的脑保护作用^[26], 还能减少室周白质化继发的神经功能缺失^[27]。与其他非竞争性拮抗剂相比, 美金刚与PCP结合位点的亲和力低, 可快速结合与解离, 避免完全、持续对NMDAR通道的阻断, 耐受性较好、毒性低、不良反应小^[28]。目前, 美金刚胺多用¹⁸F、⁹⁹Tc^m标记后作为放射性显像剂研究, 但在脑卒中的应用较少。

总之, 作用于NMDAR的PCP位点显像剂能否应用于人体, 与其亲和力、脂溶性及通道的激活程度有关。目前, 试验阶段的一些显像剂因其能严重阻断通道而有许多不良反应, 而通道的阻断程度与脂溶性和酸度系数有关, 所以, 研发亲和力较低、亲水性较高的显像剂可从一定程度上减少不良反应。但是, 低亲和力又难以成为一种有效的显像剂, Waterhouse^[17]认为, 脂溶性比正常稍低、脂水分配系数的对数值在0.5~2.0之间比较合适。

色氨酸通过犬尿氨酸途径合成犬尿喹啉酸, 后者是NMDAR拮抗剂, 其通过与甘氨酸竞争结合NMDAR上的氨基乙酰位点, 从而阻断因NMDAR过度激活所引起的神经损伤, 减少神经毒物质, 如喹啉酸、犬尿氨酸、3-羟基氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸等, 而3-羟基氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸的增加与梗死灶体积的扩大相一致, 所以能减小梗死灶的体积, 减轻炎性反应和氧化应激反应, 起到神经保护作用^[29]。Waterhouse等^[30]发现, 3-[2-[(甲氧苯胺基)羰基]乙烯基]-4, 6-二氯吲哚-2-羧酸(3-[2-[(3-methoxyphenylamino)carbonyl]ethenyl]-4, 6-dichloroinole-2-carboxylic acid, 3MPICA)作为结合NMDAR甘氨酸位点高亲和力配体, 平衡解离常数值为(4.8± 0.9)×10^-9mol, 其显像剂¹¹C-3MPICA在大鼠生物学分布实验显示, 血液中放化活性较高, 但血脑屏障通过率低, 全脑的放射性清除较快, 其平均摄取2 min后小脑和丘脑分布较多, 但海马和皮层分布较少, 特异性结合与非特异性结合之比较低, 使¹¹C-3MPICA作为脑卒中PET显像剂的体内应用受到限制。

此外, 脑卒中的潜在NMDAR显像剂还有多胺位点拮抗剂和氧化还原位点调节剂等, 有待进一步研究。

随着对NMDAR及其与脑卒中关系研究的深入, 人们认识到脑卒中后的病情发展是多因素作用的演变, 在这个连锁反应中, 有潜在的干预环节, 在此基础上的相关神经保护剂是除改善血流外的脑卒中治疗核心。脑卒中的治疗受治疗时间窗的限制, 因此早期诊断并及时予以干预是脑卒中预后的关键。作用于NMDAR的神经保护剂有潜在的诊治功效, 在了解各亚单位结构功能的基础上, 研发并证明能特异性作用于特定亚单位的药物极为关键。NMDAR的功能受协同激动剂甘氨酸调节, 可通过激动甘氨酸转运体1来增加对甘氨酸的重摄取, 减少作用于突触后膜NMDAR的甘氨酸的量, 最终下调NMDAR的过度激活。一些药物可选择性作用于NMDAR的调节酶, 如作用于NR2B的钙调蛋白依赖性蛋白激酶II, 有可能成为潜在的药物作用靶点^[31]。相对于其他脑受体显像剂, NMDAR显像剂的研究较少, NMDAR显像剂应用于脑卒中的研究则更少, 今后应在NMDAR显像剂研究的基础上, 结合脑卒中的发病机制, 改善NMDAR显像剂的脂溶性、亲和力及特异性结合与非特异性结合之比, 提高脑部摄取量等。