通过cBioPortal（http://www.cbioportal.org）对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中宫颈癌患者的数据进行分析。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、β-Tubulin抗体、Lamin B 抗体、NRF2抗体、辣根过氧化物酶偶联亲和山羊抗小鼠和兔免疫球蛋白G、Cy3标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G购于美国Proteintech公司；EGFR抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；p-共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶（ataxia telangiectasia mutated gene and Rad3-related kinase，ATR） （Thr1989）抗体购于美国GeneTex公司；p-细胞周期检查点激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）（Ser345）和血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；磷酸化组蛋白H2A变异体（phosphorylated histone 2A variant，γ-H2AX） （Ser139）抗体购自英国Abcam公司；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购于苏州吉玛基因股份有限公司；RNAimax转染试剂、NE-PER 细胞核和细胞质提取试剂购自美国Thermo Fisher公司；胎牛血清（FBS）购于日本HAKATA公司；DMEM液体培养基购于美国HyClone公司；4%组织固定液、牛血清白蛋白（BSA）、Opti MEM培养基购自美国Gibco公司；PBS缓冲液、Loading buffer、Tween-20、碘化丙锭（PI）溶液多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0.25%）购自北京索莱宝科技有限公司；快速RNA提取试剂盒购于湖南艾科瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒购自北京宝日医生物技术公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片剂购于北京Vectorlabs公司；三乙醇胺缓冲液（tris buffered saline，TBS）为天津市放射医学与分子核医学重点实验室自制；微型离心管（eppendorf，EP）购于天津本生健康科技公司；低温台式离心机（5424R型）购于德国Eppendorf公司；DMI3000B倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司；37℃ 恒温培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；CFXConnect实时定量PCR仪购自美国Bio-Rad 公司；Gammacell^®40 Exactor ¹³⁷Cs γ 射线照射源购自加拿大Best Theratronics公司。

人宫颈癌HeLa细胞由中国国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。人宫颈癌HeLa细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5% CO₂、37℃的培养箱培养。每隔48 h传代1 次，细胞消化液为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0.25%）。

细胞经¹³⁷Cs γ射线照射源进行单次8 Gy照射，吸收剂量率为0.875 Gy/min。

将人宫颈癌HeLa细胞按2种处理方式分组：（1）采用siRNA敲降HeLa细胞中的EGFR，采用¹³⁷Cs γ射线照射源照射细胞。将HeLa细胞分为对照组（HeLa siCtrl）、敲降EGFR组（HeLa siEGFR）、照射组（HeLa siCtrl+8 Gy）、敲降EGFR+照射组（HeLa siEGFR+8 Gy）。采用免疫荧光实验检测细胞中γ-H2AX foci的数量；采用流式细胞术检测细胞周期；采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测NRF2下游靶基因；采用核质分离实验分离胞质、胞核蛋白；采用蛋白质免疫印迹法检测NRF2、EGFR、HO-1和ATR在Thr1989位点的磷酸化水平，CHK1在Ser345位点的磷酸化水平。（2）采用siRNA敲降HeLa细胞中的NRF2，采用¹³⁷Cs γ射线照射源照射细胞。将HeLa 细胞分为对照组（HeLa siCtrl）、敲降NRF2组（HeLa siNRF2）、照射组（HeLa siCtrl+8 Gy）、敲降NRF2+照射组（HeLa siNRF2+8 Gy）。采用免疫荧光实验检测细胞中γ-H2AX foci的数量。

EGFR的siRNA序列为：5′-GGAGAUAAGUGAUGGAGAUTT-3′

NRF2的siRNA序列为：5′-GGCAUUUCACUAAACACAATT-3′

转染前1 d，将处于对数生长期的HeLa细胞按5×10⁵ 个/孔接种于6孔板中，待细胞密度为50%左右时，更换为1 ml新的含10%胎牛血清的DMEM培养基。取4 μl siRNA 和4 μl RNAimax转染试剂分别稀释于200 μl Opti MEM培养基中，将2种溶液混合，使用移液器缓慢吹打混匀，室温放置5 min。将混合液加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，缓慢晃动培养皿使其分布均匀。培养基在37℃、5% CO₂的细胞培养箱中孵育8 h，加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基（不含抗生素），继续培养至24 h，收集细胞用于后续实验。

照射后6 h，收集HeLa细胞至EP管，使用预冷的PBS洗2次，吸干PBS，加入含蛋白酶抑制剂的细胞质提取试剂Ⅰ（CER Ⅰ），涡旋EP管15 s，使细胞颗粒完全悬浮。将EP管放在冰上孵育10 min，向EP管中加入细胞质提取试剂Ⅱ（CER Ⅱ），涡旋EP管5 s；再将EP管在冰上孵育1 min，涡旋5 s。将EP管在离心机（16 000×g，4℃）中离心5 min，立即将上清液（细胞质提取液）转移到另一个干净的EP管中，加入1/3 体积的4×Loading buffer，混匀， 100℃裂解变性10 min。将产生的含核的不溶性（球团）部分悬浮于含有蛋白酶抑制剂的核提取试剂（NER）中，将涡旋调至最高，涡旋15 s。将样本放在冰上孵育，每10 min涡旋15 s，共涡旋5次。将样本在离心机中以最大速度（16 000×g）离心10 s，立即将上清液（核提取液）转移到一个干净的预冷EP管中，加入1/3 体积的4×Loading buffer，于100℃下进行10 min裂解变性。

将对数生长期的HeLa细胞按1×10⁵个/孔接种到12孔板中的载玻片上，待细胞完全贴壁后进行8 Gy照射，分别在照射6、12、24 h后取出载玻片，用PBS洗3次，每次5 min；加入4%组织固定液，室温固定20 min，之后再用PBS洗3次，每次5 min；使用预冷的0.3% 聚乙二醇辛基苯基醚（Trinton X-100）室温处理载玻片30 min，PBS洗3次，每次5 min。使用1% BSA（PBS配置）4℃封闭载玻片2 h，在γ-H2AX抗体中4℃孵育12 h，用PBS洗3次，每次5 min。用Cy3标记的山羊抗鼠和兔免疫球蛋白G室温避光孵育载玻片1 h；用PBS洗3次，每次5 min。用含4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片，将载玻片转移至倒置荧光显微镜下拍照并记录细胞中γ-H2AX foci的数量。

采用Western blot法检测EGFR、NRF2、ATR、p-ATR、CHK1、p-CHK1的蛋白表达水平。分别提取各组HeLa细胞的总蛋白，检测蛋白浓度，取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳分离，转膜，封闭2 h，加入p-ATR（Thr1989）（1∶1 000）、p-CHK1（Ser345）（1∶1 000）、EGFR（1∶1 000）、NRF2（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）、β-Tubulin（1∶5 000）、Lamin B（1∶5 000）一抗稀释液，4℃ 孵育过夜，使用TBST（tris buffered saline with Tween-20）洗涤30 min，加入二抗（HRP偶联亲和山羊抗小鼠和兔免疫球蛋白G）（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST洗涤30 min后显影。

采用快速RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录为互补DNA（cDNA），检测EGFR、HO-1基因的表达，同时检测GAPDH基因的表达，作为内参。扩增条件：95℃ 激活10 min；95℃ 变性 15 s、60℃ 退火1 min，循环35 次。应用RT-PCR 仪分析荧光强度，采用2^−∆∆Ct法对数据进行分析。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下。

GAPDH 引物序列：

正向5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′

反向5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′

EGFR引物序列：

正向5′-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3′

反向5′-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3′

HO-1引物序列：

正向 5′-CTTCTTCACCTTCCCCAACA-3′

反向 5′-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3′

将对数生长期的HeLa细胞按5×10⁵ 个/孔接种于6孔板中。待细胞完全贴壁后，对细胞进行8 Gy照射，6 h后收集细胞，用PBS清洗2次，去除PBS后用预冷的70%乙醇4℃固定细胞2 h，4℃离心（2 000 r/min，离心半径为10 cm，5 min）去除乙醇，使用预冷的PBS清洗细胞1次，去除PBS，使用碘化丙啶（PI）缓冲液重悬细胞，37℃避光染色30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期。

应用IBM SPSS Statistics 22.0 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以 $ \bar{x} $±s 表示，组间比较采用两独立样本t检验（方差齐）。P<0.05 为差异有统计学意义。

宫颈癌患者中存在5%的EGFR基因突变，其中扩增型突变是主要的突变类型（图1A）。与未发生EGFR基因突变的宫颈癌患者相比，突变患者的生存期更短（图1B）。以上结果提示EGFR对宫颈癌患者的生存率至关重要，可作为宫颈癌的潜在治疗靶标。

图  1  宫颈癌患者的EGFR遗传改变及与生存率的关系

Figure 1.  Genetic alterations of epidermal growth factor receptor in cervical cancer patients and its relationship with survival rate

细胞免疫荧光实验结果显示，在8 Gy照射后6、12、24 h，HeLa siEGFR组细胞中γ-H2AX foci的数量均多于HeLa siCtrl组[（94.00±1.00）% 对（89.67±2.03）%、（72.33±1.76）% 对（60.00±1.73）%、（43.00±2.31）% 对（26.33±1.20）%]，且差异均有统计学意义（均P<0.05）（图2A）。8 Gy照射后6、12、24 h，HeLa siNRF2组细胞中γ-H2AX foci的数量均多于HeLa siCtrl组[（96.67±0.88）%对（89.67±2.03）%、（77.33±1.20）% 对（60.00±1.73）%、（54.33±2.19）% 对（26.33±1.20）%]，且差异均有统计学意义（均P<0.05）（图2B）。上述实验结果表明，敲降EGFR或者NRF2均可降低人宫颈癌HeLa细胞的DNA损伤修复能力。

图  2  EGFR、NRF2对人宫颈癌HeLa细胞DNA损伤修复的影响

Figure 2.  Effect of epidermal growth factor receptor and nuclear factor-E2-related factor 2 on DNA damage and repair of cervical cancer HeLa cells

Western blot实验结果显示，HeLa细胞经8 Gy照射后，EGFR和NRF2蛋白水平均升高，在6 h时达到最大值（图3A），提示在HeLa细胞中EGFR和NRF2可能在调控DNA的损伤修复过程中发挥了重要作用。RT-qPCR实验结果显示，正常条件下敲降EGFR对HO-1表达无明显影响，且差异无统计学意义（t=0.925，P>0.05）。与HeLa siCtrl组细胞比较，HeLa siEGFR+8 Gy的HO-1表达下降66.66%（1.35±0.10对0.45±0.02），且差异有统计学意义（P<0.05），辐射可以导致NRF2靶基因HO-1的表达水平升高（图3B）。流式细胞术结果显示，HeLa siCtrl、HeLa siEGFR、HeLa siCtrl+8 Gy、HeLa siEGFR+8 Gy组细胞的G2周期细胞比例分别是（18.83±0.44）%、（17.07±0.94）%、（44.90±2.81）%、（29.53±2.10）%，与HeLa siCtrl+8 Gy组细胞相比，HeLa siEGFR+8 Gy组的HeLa细胞G2/M期阻滞明显受损，且差异有统计学意义（P<0.05）（图3C）。Western blot实验结果显示，敲降EGFR显著抑制了辐射导致的CHK1的磷酸化和HO-1蛋白水平的升高（图3D）。以上实验结果表明，电离辐射可以引起NRF2和EGFR蛋白水平升高、NRF2下游的DNA损伤响应信号通路和靶蛋白的激活以及G2/M期阻滞。敲降EGFR会抑制电离辐射导致的NRF2下游的ATR-CHK1信号通路的活化和HO-1的激活，并且G2/M期阻滞受损。

图  3  敲降EGFR对HeLa细胞中NRF2下游信号通路及靶蛋白的影响

Figure 3.  Effects of epidermal growth factor receptor knockdown on nuclear factor-E2-related factor 2 downstream signaling pathway and target protein in HeLa cells

NRF2进入细胞核中才能发挥辐射抵抗的作用，NRF2的核定位对于响应电离辐射至关重要，我们采用核质分离实验来检测EGFR对NRF2核定位的影响，结果如图4所示，敲降EGFR会导致NRF2蛋白水平下降；辐射使在细胞核内定位的NRF2蛋白增加，而敲降EGFR会减少辐射导致的NRF2蛋白在细胞核中的定位，说明EGFR很可能通过促进NRF2的核定位来调控辐射诱导的DNA损伤修复。

图  4  照射和未照射条件下敲降EGFR后HeLa细胞中EGFR、NRF2蛋白在细胞质和细胞核中表达水平的比较

Figure 4.  Comparison of epidermal growth factor receptor and nuclear factor-E2-related factor 2 protein expression levels in cytoplasm and nucleus of HeLa cells after knocking down epidermal growth factor receptor under irradiation and non-irradiation conditions

放疗是宫颈癌的主要治疗方法之一，一半以上的宫颈癌患者需要接受放疗^[10]。近年来， 随着放疗技术的发展，以三维体外照射及三维腔内照射为主的放疗新技术被广泛应用，宫颈癌患者的治疗取得了良好的效果，但辐射抗性仍是导致肿瘤复发或持续的主要因素，因此抑制肿瘤细胞DNA的损伤修复仍非常必要^[11]。有研究报道，大约70%的宫颈癌患者中存在EGFR过表达的情况，并且EGFR过表达与疾病特异性生存期（DSS）的缩短相关^[12]。本研究对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中宫颈癌患者的数据进行分析，发现EGFR突变的宫颈癌患者比例仅为5%，远低于之前的研究结果^[12]，但疾病特异性生存期（DSS）的缩短确实与EGFR过表达相关，所以EGFR的过表达可能更多发生在mRNA或者蛋白水平。本研究的结果表明，照射后HeLa细胞中EGFR蛋白的表达水平明显升高。为了进一步评估EGFR对宫颈癌细胞DNA损伤修复的影响，我们通过免疫荧光实验观察敲降EGFR后受照HeLa细胞中的DNA损伤情况，结果表明敲降EGFR会降低HeLa细胞的DNA损伤修复能力。

辐射通过直接导致DNA双链断裂或者产生活性氧间接对DNA造成损伤。为了减轻对遗传物质的伤害，细胞会启动DNA损伤反应（DDR）促进对损伤DNA的修复，使细胞周期进程停滞，为修复受损的DNA提供足够的时间^[13-14]。通过Western blot、RT-qPCR和流式细胞术实验，我们发现敲降EGFR后，受照射HeLa细胞中ATR-CHK1信号通路的激活受到抑制，HO-1的表达水平降低、细胞G2/M期阻滞受损。这提示EGFR可能通过影响NRF2的功能发挥辐射抵抗作用。

NRF2是基础亮氨酸拉链家族的成员，通过抗氧化反应元件（ARE） 激活细胞内编码抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶的基因转录。一般情况下，Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）通过泛素介导的蛋白酶体降解负向调节NRF2活性^[15] 。当细胞暴露于氧化、亲电或外来生物刺激时，NRF2会摆脱Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）的控制，转位到细胞核中，与Maf家族的一个小蛋白形成异源二聚体，调控含有抗氧化反应元件（ARE）的下游基因的转录^{[5, 15]}。有研究报道，NRF2的细胞保护功能也可导致对肿瘤细胞的保护，从而促进肿瘤细胞的转化、生长、转移和化疗耐药的形成^[16]。有研究结果表明，NRF2通过促进ATR激活和G2/M期阻滞来保持基因组的完整性，DNA发生损伤时，ATR调控的一个主要应答过程是细胞周期阻滞。ATR可通过自身活化并磷酸化蛋白激酶CHK1引起细胞周期阻滞^[17]。通过核质分离实验结果，我们发现敲降EGFR明显减少了辐射诱导的细胞核内NRF2蛋白水平的增加。通过免疫荧光实验结果，我们发现敲降NRF2后，HeLa细胞的DNA损伤修复能力降低，表明敲降EGFR会导致NRF2下游信号通路受阻，即电离辐射诱导HeLa细胞DNA损伤修复有赖于EGFR的表达。但目前我们还不确定EGFR是如何调控NRF2在胞内的分布，在今后的研究中，将进一步探索EGFR对NRF2作用的具体机制。

综上所述，本研究采用人宫颈癌HeLa细胞，从细胞及分子水平证实电离辐射后EGFR可促进NRF2蛋白向细胞核内转移，从而激活NRF2下游的ATR/CHK1信号通路及靶基因HO-1的表达，提高细胞的DNA损伤修复能力。因此，我们发现了EGFR在人宫颈癌HeLa细胞辐射抗性中发挥作用的一种可能机制，为靶向EGFR在宫颈癌临床治疗中的应用提供了分子基础及理论依据。

利益冲突　所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明　高宇负责实验的实施、论文的撰写与修订；徐畅负责方法的建立、数据的分析、论文的审阅；刘强负责研究命题的设计、论文的修订