胎牛血清购自上海传秋生物科技有限公司，1640培养液购自美国HyClone公司，慢病毒颗粒购自上海吉凯公司，小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购自苏州吉玛基因股份有限公司，Trizol试剂购自美国赛默飞世尔科技公司，磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）抗体购自美国Abcam公司，Cy3标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G购自美国Proteintech公司，Matrigel基质胶和Transwell小室购自美国康宁公司，正常熔点琼脂糖购自美国Biowest公司，低熔点琼脂糖购自美国Promega公司，Super GelRed染液购自苏州宇恒生物科技公司，逆转录试剂盒购自北京宝日医生物技术公司，结晶紫、多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和纤连蛋白购自北京索莱宝科技有限公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自大连美仑生物技术有限公司。DMI3000B倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司，37℃恒温培养箱购自上海力申科学仪器有限公司，Gammacell^®40 Exactor ¹³⁷Cs γ射线照射源购自加拿大Best Theratronics公司，CFX Connect实时定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

人NSCLC H460、H358细胞均购自美国模式培养物集存库（ATCC）细胞库，均采用含10%胎牛血清的1640培养液，在含5%CO₂的37℃恒温培养箱中培养，待细胞融合度达到80%时进行传代培养。选择处于对数生长期的细胞进行后续实验。

慢病毒LV-CRIM1-RNAi（LV：慢病毒载体；RNAi：RNA干扰）和阴性对照LV-CON均由上海吉凯生物公司构建。将H460、H358细胞按照1×10⁵个/孔接种于12孔板中，培养24 h，用慢病毒颗粒（感染复数=10）进行感染。感染12 h后，将含病毒的培养液换为完全培养基。感染96 h后，用嘌呤霉素筛选，后扩大培养。将H460、H358细胞分别分为3组：H460细胞、H460-shCRIM1细胞、H460-shNC细胞和H358细胞、H358-shCRIM1细胞、H358-shNC细胞（其中shCRIM1表示用shRNA敲降CRIM1的表达，shNC表示阴性对照）。

将H358细胞按照1×10⁶个/孔接种于6孔板中，待细胞融合度达到70%时，进行转染。将siRNA转染H358细胞分为2组：H358-NC细胞（转染siRNA-NC，即阴性对照）和H358-siCRIM1细胞（转染siRNA-CRIM1，即CRIMI敲降序列：正义链为5′-CCUUAUUGCUGGCUGCAAUTT-3′；反义链为 5′-AUUGCAGCCAGCAAUAAGGTT-3′）。转染24 h后弃去原有培养液，加入新鲜完全培养基，继续培养24 h后用Trizol试剂裂解细胞，采用荧光定量PCR法检测干扰效率。

雄性BALB/c-nu裸鼠30只，6~8周龄，体重（20±2）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[许可证号：SCXK（京）2020-0004]，饲养于中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所实验动物中心。所有动物在无特定病原体条件下，于恒温（23℃±2℃）、恒湿（45%~50%）、无菌净化屏障系统内饲养，随意采食全价鼠饲料及清洁水。动物实验开展前获得了中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所动物伦理委员会的批准（批准号：IRM-DWLL-2020140）。

将30只裸鼠分为3组，每组10只，分别接种H460、H460-shCRIM1、H460-shNC细胞。将处于对数生长期的上述3种细胞经胰酶消化，离心（115×g）5 min后弃上清，用PBS洗涤2次并离心（115×g）5 min，用Matrigel基质胶混合制备成5×10⁶个/mL的细胞悬液。于BALB/c-nu裸鼠右腋前线第二肋上缘，右肺第二叶注射100 μL细胞悬液，2周后将小鼠全部处死并取肺脏。

使用¹³⁷Cs γ射线照射源对细胞进行照射，剂量率为1 Gy/min。

采用Trizol法提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，检测相关基因的表达，包括CRIM1、连接黏附分子2（junctional adhesion molecule 2，JAM2）、连接蛋白3（nectin cell adhesion molecule 3，NECTIN3）和紧密连接蛋白4（claudin 4，CLDN4）等基因，同时检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH)基因的表达，并作为内参。扩增条件：95℃激活10 min；95℃变性 15 s、60℃退火1 min，循环35次。应用实时定量PCR仪分析荧光强度，数据采用 2^−ΔΔCt 法进行分析。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下。

GAPDH引物序列：

正向5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；

反向5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；

CRIM1引物序列：

正向5′-ACGCGATCACAATGGTTGTCGG-3′；

反向5′-GGCATCAGTAAGGAAACCGAAGG-3′；

NECTIN3引物序列：

正向5′- ATTCCCGCTTGGAAATGCCCAG-3′；

反向5′- GCTGCTACTGTTTCATTTCCTCC-3′；

CLDN4引物序列：

正向5′- AGTGCAAGGTGTACGACTCGCT-3′；

反向5′- CGCTTTCATCCTCCAGGCAGTT-3′；

JAM2引物序列：

正向5′- AGACTTGGCTCCCAAAGCACCA-3′；

反向5′- TTCCCAGGACACCTGCGATATC-3′。

分别将500个H460、H460-shCRIM1、H460-shNC细胞接种至6孔培养板中，待细胞贴壁后，分别进行0、1、2、4 Gy照射，照射时间分别为0、1、2、4 min，并继续培养至出现肉眼可见的克隆，共计7 d。弃掉培养基，用结晶紫染液染色。肉眼进行克隆计数，以每团细胞数>50个作为1个克隆。根据公式进行计算，细胞克隆形成率＝照射细胞克隆数/未照射（0 Gy照射）同种细胞克隆数×100%。

将H460、H460-shNC、H460-shCRIM1细胞接种至载玻片上24 h后，行6、8、12 Gy照射，照射时间分别为6、8、12 min，12 h后取出载玻片，PBS清洗，4%多聚甲醛室温下固定15 min，0.3% Triton X-100室温下处理细胞15 min，5%牛血清蛋白室温封闭2 h，加入磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）一抗30 μL，4℃孵育过夜，PBS清洗3次，加入二抗（Cy3标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G）。室温孵育1 h，PBS清洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后于荧光显微镜下拍照并记录细胞中磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）foci数。

收集H460、H460-shNC、H460-shCRIM1细胞，用PBS冲洗2次，并用PBS重悬，调节细胞悬液密度至4×10⁵个/mL，经8 Gy照射后立即铺板。彗星实验板（自制）每孔铺入0.75%正常熔点琼脂糖凝胶约500 μL，待凝结后，将30 μL细胞悬液与70 μL 0.75%低熔点琼脂糖凝胶混匀并滴于上层铺平，将彗星实验板完全浸没在细胞裂解液中，于4℃裂解2.5 h。再将彗星实验板移入装有Tris-硼酸缓冲液的电泳槽中进行DNA解旋20 min（30 V电压下电泳20 min），电泳结束后用中和缓冲液中和20 min。PBS冲洗彗星实验板后用Super GelRed染液染色，在荧光显微镜下拍照。应用CASP 6.0软件（http://www.casp-program.org）分析图像；casp_1.2.3b1彗星分析软件（波兰弗罗茨瓦夫大学）分析olive尾距。

用胰蛋白酶消化H460、H460-shCRIM1、H460-shNC细胞和H358、H358-shCRIM1、H358-shNC细胞，再用无血清培养基稀释。在Transwell小室的上室中加入5×10⁴个细胞，在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培养基，将上室放入24孔板后放入细胞培养箱继续培养。24 h后取出上室，用乙醇配制的0.5%结晶紫固定染色30 min，PBS清洗，擦去上室内残留细胞，晾干后用倒置显微镜拍照。

在实验前12 h，将纤连蛋白涂布于96孔板中；将胰蛋白酶消化后的H460、H460-shCRIM1、H460-shNC细胞和H358、H358-shCRIM1、H358-shNC细胞铺至上述96孔板中，37℃孵育20 min，用无血清1640培养基洗去未黏附细胞，再加入无血清1640培养基，37℃孵育4 h后加入细胞计数试剂盒8（CCK-8）试剂，检测450 nm波长下的吸光度（A450值），根据吸光度值判定细胞黏附能力。

将小鼠处死后迅速取出肺脏，经生理盐水漂洗后，用4%中性甲醛溶液固定，在左右肺的最大截面处进行组织病理切片，然后用苏木精-伊红染色，在显微镜下观察肺组织中肿瘤的分布情况。

用Trizol法提取H460-shCRIM1、H460-shNC细胞总RNA，每种细胞设3个重复样品，并进行测序（委托广州基迪奥公司完成）。对得到的数据进行相关分析，以差异表达倍数>2、校准后P<0.05为筛选标准，筛选得到差异基因。利用基因本体论（gene ontology，GO）数据库对全部差异基因进行注释，京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库对全部差异基因进行通路分析，注释与通路分析均使用北京大学KOBAS系统（http://kobas.cbi.pku.edu.cn）进行，采用超几何分布计算差异基因显著富集的GO 条目和KEGG通路，P<0.05为显著富集。筛选得到目的基因后进行荧光定量PCR检测，具体方法同1.6节。

应用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以$\bar x $±s表示，在方差齐的条件下，组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

细胞克隆形成实验结果显示，H460-shNC细胞和H460-shCRIM1细胞在接受1、2、4 Gy照射后的克隆形成率分别为（87.04±8.04）%、（48.23±1.22）%、（9.45±4.21）%和（58.01±4.39）%、（31.43±0.08）%、（4.79±1.54）%。与H460-shNC细胞相比，1、2 Gy照射后H460-shCRIM1细胞克隆形成率明显降低，且差异均有统计学意义（t=4.48、19.50，均P<0.05），4 Gy照射后H460-shCRIM1细胞克隆形成率也呈现出下降的趋势（图1A）。彗星实验结果显示，H460-shCRIM1细胞的olive尾距长于H460-shNC细胞，且差异有统计学意义（1.27±0.54对1.05±0.42，t=2.14，P<0.05）（图1B）。细胞免疫荧光实验结果显示，H460-shCRIM1细胞受照后的磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）foci数多于H460-shNC细胞（6 Gy：14.33±2.81对11.00±3.92；8 Gy：34.00±11.14对21.17±6.15；12 Gy：25.80±3.96对20.17±3.31），且差异均有统计学意义（t=2.45、5.52、2.47，均P<0.05）（图1C）。由此可见，敲降H460细胞内CRIM1的表达可以增强其辐射敏感性。H358细胞由于克隆形成能力较差，未检测其辐射敏感性。

图  1  CRIM1对非小细胞肺癌H460细胞辐射敏感性的影响

Figure 1.  Effect of cysteine-rich moter neuron 1 on radiosensitivity of non-small cell lung cancer H460 cell

由图2可见，shRNA可以从转录水平敲降H460、H358细胞中CRIM1 mRNA的相对表达量（t=35.35、22.50，均P<0.05）。Transwell实验结果显示，H460-shCRIM1细胞的迁移率较H460-shNC细胞明显升高（t=4.73，P<0.05），黏附能力下降（t=2.86，P<0.05）（图3A）；H358-shCRIM1细胞的迁移率较H358-shNC细胞明显升高（t=10.19，P<0.05），黏附能力下降（t=3.66，P<0.05）（图3B）。小鼠肺内原位接种肿瘤实验结果显示，接种后2周，H460-shCRIM1细胞的肺内转移灶明显多于H460-shNC细胞（图3C、D），且在纵隔和胸膜下出现大量的转移灶。

图  2  短发夹RNA敲降后非小细胞肺癌H460、H358细胞中CRIMI mRNA的相对表达量

Figure 2.  Effect of short hairpin RNA on cysteine-rich motor neuron 1 expression in non-small cell lung cancer H460 and H358 cells

图  3  CRIM1对非小细胞肺癌H460、H358细胞转移的影响

Figure 3.  Effect of cysteine-rich motor neuron 1 on the metastasis of non-small cell lung cancer H460 and H358 cells

转录组测序结果显示，通过主成分分析（PCA）结果发现，降维分析后H460-shCRIM1细胞和H460-shNC细胞的样本聚集度较高（图4A）。与H460-shNC细胞相比，H460-shCRIM1细胞中表达上调基因58个、下调基因39个。对所有97个基因和39个下调基因的KEGG富集分析结果（图4B）显示，其显著变化的通路均富集在细胞黏附分子通路上，富集的基因是参与细胞黏附连接的NECTIN3、CLDN4基因和构成细胞紧密连接的JAM2基因，其相对表达量在H460-shCRIM1细胞中均有所下降。

图  4  敲降非小细胞肺癌H460细胞中CRIM1的表达后的转录组基因分析

Figure 4.  Transcriptome gene analysis after reducing cysteine-rich motor neuron 1 expression in non-small cell lung cancer H460 cell

由图5可见，与H460-shNC细胞比较，H460-shCRIM1细胞中的JAM2、NECTIN3和CLDN4基因的相对表达量分别下降了86.66%、49.35%、30.27%（t=47.52、7.47、18.98，均P<0.05）（图5A）。与H358-siNC细胞比较，H358-siCRIM1细胞中的JAM2、NECTIN3和CLDN4基因的相对表达量分别下降了36.60%、31.70%、50.00%（t=7.40、7.10、16.56，均P<0.05）（图5C）。由此可见，CRIM1的表达降低可能会导致NSCLC中细胞黏附分子转录水平的降低。

图  5  敲降非小细胞肺癌H460、H358细胞中CRIM1的表达对细胞黏附相关基因表达的影响

Figure 5.  Expression of cell adhesion-related genes after reducing cysteine-rich motor neuron 1 expression in non-small cell lung cancer H460 and H358 cells

放疗尽管在NSCLC的治疗上取得了一定进展，但进一步提高NSCLC的辐射敏感性仍然是非常有必要的。Hurov等^[11]对人骨肉瘤U2OS细胞进行全基因组RNA干扰分析，筛选结果显示CRIM1可能与降低U2OS细胞的辐射敏感性相关。本研究结果显示，敲降CRIM1的H460-shCRIM1细胞照射后的克隆形成能力降低。DNA是辐射的直接作用靶点，因此DNA的损伤程度可间接反映细胞对辐射的敏感性。为了进一步评估CRIM1对NSCLC H460细胞辐射敏感性的影响，我们通过慧星实验和细胞免疫荧光实验观察了敲降CRIM1后受照H460细胞的DNA损伤情况，结果也表明敲降CRIM1会增加照射对H460细胞DNA的损伤程度，增强其辐射敏感性。随后，我们分析了转录组学结果，但未显示出与辐射敏感性紧密相关的信号通路的改变。推测CRIM1可能通过不依赖于转录水平变化的方式来影响H460细胞的辐射敏感性。

转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而肿瘤的迁移、侵袭、黏附和血管形成等能力将直接影响肿瘤的转移。本研究主要从迁移和黏附2个角度阐述了CRIM1对NSCLC细胞转移能力的影响。首先采用shRNA慢病毒感染与siRNA瞬时转染2种NSCLC H460和H358细胞，分别采用Transwell实验和细胞黏附实验评估了细胞的迁移和黏附能力，结果表明敲降CRIM1可以促进NSCLC细胞的迁移和黏附，进而促进NSCLC细胞的转移；且肺内原位接种H460细胞的体内实验结果也表明，CRIM1低表达的肺癌细胞更易形成多发的转移灶。由此证实CRIM1具有抑制NSCLC细胞转移的作用。CRIM1与肿瘤转移的关系的研究已有报道。Ogasawara等^[12]的研究结果表明，CRIM1可抑制肾癌细胞的侵袭和转移；Zeng等^[13]的研究结果显示，敲降CRIM1可抑制肺癌A549细胞在体外的迁移。本研究结果与Ogasawara等^[12]的结果一致，但与Zeng等^[13]的研究结果相反。选用细胞系的不同可能是造成这一差异的原因之一。另外，我们还比较了NSCLC细胞和多种小细胞肺癌细胞中CRIM1的表达，结果发现CRIM1在小细胞肺癌细胞中普遍低表达（研究结果尚未发表）。而这与小细胞肺癌易转移、对辐射敏感的特性相吻合，这也与本研究的结果相吻合。目前，我们正在就CRIM1对小细胞肺癌转移的影响进行探讨，以期深入了解CRIM1与肺癌转移的关系。

关于CRIM1影响NSCLC细胞转移的具体机制，我们分析了敲降CRIM1和阴性对照NSCLC细胞的转录组学的变化。结果发现，细胞黏附分子通路在H460-shNC细胞和H460-shCRIM1细胞之间的差异有统计学意义，通路中的3个细胞黏附分子JAM2、CLDN4、NECTIN3在敲降CRIM1的H460和H358细胞中的相对表达量均明显下调。这提示CRIM1可能是通过影响NSCLC细胞间的黏附发挥其改变肺癌转移的作用。对非洲爪蟾的神经板发育的研究结果也表明，CRIM1主要通过与钙黏着蛋白和β-catenin形成复合物来影响细胞连接复合物的形成和稳定，而该功能对于细胞黏附至关重要^[14]。细胞黏附是由桥粒、黏附连接和紧密连接等组成的细胞间锚定和信号传递的场所，用于维持和形成正常的细胞间黏附。细胞黏附的失调在恶性肿瘤的转化和转移过程中起着至关重要的作用^[15-16]。细胞黏附连接除发挥锚定作用外，对肌动蛋白细胞骨架、细胞内信号和转录过程的调节均有重要意义。因此，连接通讯系统的失调在肿瘤侵袭中具有特殊意义^[17-18]。紧密连接及其相关黏附因子的失调也与肿瘤的转化和侵袭有很大关系。多项研究结果显示，在乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌和卵巢癌中，CLDN失调明显会导致肿瘤的发展和转移的潜能增加^[19-20]。

因此，我们后期将使用电镜观察肿瘤组织中的细胞间连接，包括黏附连接和紧密连接的变化，以进一步确定CRIM1对细胞连接的影响。对于CRIM1是如何影响细胞黏附分子的水平及其具体的机制，还有待进一步的研究。

综上所述，抑制CRIM1能够增强NSCLC H460细胞的辐射敏感性；CRIM1可能通过影响肿瘤细胞连接的方式影响NSCLC的转移。

利益冲突　本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明　李科君负责实验的实施、论文的撰写与修订；赵雯月负责细胞学的实验；李娜负责动物的实验、数据的获取；王彦负责方法的建立、数据的分析；刘强负责论文的审阅；杜利清负责研究命题的设计、论文的修订。