DMEM液体培养基、胎牛血清均购自以色列Biological生物科技公司；青链霉素双抗购自美国Hyclone公司；Hoechst 33342反应液、二甲基亚砜、谷氨酰胺、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]溶液、RIPA裂解液、蛋白加样缓冲液、Triton X-100、牛血清白蛋白、抗荧光衰减封片剂均购自北京索莱宝科技有限公司；Lipofectamine 3000、Trizol试剂均购自美国Invitrogen生命技术有限公司；ECL超敏发光液购自白鲨生物科技公司；短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）ASTL（sh-ASTL）质粒购自苏州金唯智生物科技有限公司；cDNA 合成试剂盒购自日本 TaKaRa公司；实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均购自美国赛默飞世尔科技公司；兔抗人ASTL抗体购自上海沪震生物科技公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）抗体、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体均购自美国Proteintech公司；AKT抗体、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G及荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G均购自英国Abcam公司；5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）试剂盒购自南京恩晶科技生物有限公司；细胞膜蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒均购自上海贝博生物科技有限公司。Gammacell^®40 Exactor ¹³⁷Cs γ射线照射源，剂量率为1 Gy/min，购自加拿大Best Theratronics公司；RT-6500酶标分析仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司；D3024R离心机购自大龙兴创实验仪器北京股份公司；TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜购自德国徕卡公司。

人宫颈癌HeLa细胞、ME-180细胞均购自美国模式菌种收集中心。用含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM液体培养基培养ME-180细胞；用含10%胎牛血清、3%谷氨酰胺、1%青链霉素双抗的DMEM液体培养基培养HeLa细胞。培养条件为5% CO₂、37℃恒温培养，细胞铺满培养瓶约80%时进行传代亚培养。

根据细胞处理方法的不同，按以下方式进行分组。（1）将ME-180细胞分为4组：对照组、照射组（4 Gy）、ASTL抗体组和ASTL抗体+照射组（4 Gy），采用EdU染色、MTT实验检测细胞的存活情况和增殖能力，并于照射后0、24、48、72 h采用免疫荧光、Western blot实验检测ASTL在细胞中的定位情况。（2）将ME-180细胞分为2组：照射组、ASTL抗体+照射组，分别进行0、2、4、8 Gy照射，并采用克隆形成实验检测每组细胞的增殖能力。（3）将HeLa细胞分为2组：对照组、ASTL抗体组，分别进行0、2、4、8 Gy照射，采用MTT实验检测细胞的存活情况。（4）将ME-180细胞分为2组：短发夹RNA对照组（sh-对照组）、短发夹RNA ASTL转染组（sh-ASTL组），采用qRT-PCR、Western blot实验检测AKT等靶基因的表达；同时，分别用0、5、10 nmoL/L的抗体处理ME-180细胞，采用Western blot实验检测抗体中和对靶基因表达情况的影响。（5）将ME-180细胞分为2组：对照组、照射组（4 Gy），采用Western blot实验检测ASTL、AKT等靶基因的表达情况。

以上除第（4）组实验提到的抗体浓度，其他实验所用抗体浓度均为5 nmoL/L。所有照射均使用¹³⁷Cs γ射线照射源，剂量率为1 Gy/min。

将接受不同处理后且处于对数生长期的ME-180细胞，按1×10³个/孔接种于96孔板中，4 Gy照射后24 h进行EdU染色实验。制备适量50 μmol/L的EdU培养基，每孔100 μL，37℃孵育2 h；PBS洗2次，每次5 min；加入50 μL 4%多聚甲醛室温固定30 min，固定完成后弃去细胞固定液；加入3%牛血清白蛋白洗2次；加入100 μL 0.5% Triton X-100的PBS，室温孵育10 min；加入100 μL PBS，脱色摇床洗5 min；加入100 μL 1×X Apollo^®染色反应液，室温、避光条件下，脱色摇床孵育30 min；弃除染色反应液后，加入渗透剂（0.5% Triton X-100的PBS），每孔100 μL，室温反应10 min，除去渗透剂；加入100 μL的甲醇洗2次，每次5 min；加入100 μL PBS洗涤，5 min；加入100 μL 1×Hoechst 33342反应液，摇床孵育30 min，注意避光，弃去反应液；加入100 μL PBS清洗2次。染色完成后，立即观察并获取图像。

ME-180细胞、HeLa细胞接受不同剂量（0、2、4、8 Gy）的射线照射后，按3×10⁴个/孔接种于96孔板中，培养20 h后，每孔加入20 μL的 MTT溶液，于37℃的CO₂恒温培养箱中培养4 h，加入100 μL二甲基亚砜，摇床低速振摇10 min。使用酶标仪检测各组细胞在490 nm处的吸光度。

ME-180细胞接受不同剂量（0、2、4、8 Gy）的射线照射后，立即将约2000个不同处理组的细胞接种至60 mm的培养皿中。细胞连续培养3周至出现肉眼可见的克隆时，弃掉培养基用甲醇固定30 min，加姬姆萨应用液染色30 min，流水洗净，计数细胞数≥50个作为1个克隆，计算克隆数。细胞克隆形成率=照射细胞克隆数/未照射同种细胞克隆数×100%。

将1×10⁵个ME-180细胞接种到放置有盖玻片的6孔板中，24 h后进行4 Gy照射4 min。（1）分别在照射后0、24、48、72 h去掉培养基，PBS清洗2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温下固定15 min。（2）0.3% Triton X-100 室温下处理细胞15 min，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h。（3）加入兔抗人ASTL抗体（1∶400 稀释）30 μL，4℃孵育过夜，PBS 清洗 3次，加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1000 稀释） ，室温孵育1 h，PBS 清洗。（4）PBS中摇晃清洗3次，滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液于盖玻片，室温孵育30 min。（5）PBS中摇晃清洗3次，用30 μL抗荧光衰减封片剂进行封片，干燥后于荧光显微镜下观察。使用激光扫描共聚焦显微镜观察照射后不同时间点（0、24、48、72 h）ASTL在细胞中的定位情况。

PBS清洗处理后的ME-180细胞，将150 μL/孔 RIPA裂解液加入6孔板，并置于冰上裂解细胞2 h，10 000×g离心10 min，取上清液。加入等体积的2倍浓度的蛋白加样缓冲液，沸水煮沸5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳结束后转膜，将聚偏氟乙烯（PVDF）膜切成凝胶大小，在100%甲醇中预浸一下后浸泡在缓冲液中，保持膜和凝胶湿润；转膜结束后，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；依次加入兔抗人ASTL抗体（1∶400稀释）、AKT抗体、pAKT抗体、ERK1 抗体（均为1∶1000稀释），4℃孵育过夜；用TBST（ tris buffered saline with tween）缓冲液洗3次，每次15 min；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶2000稀释）室温孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min；用ECL（enhanced chemiluminescent）发光法检测蛋白的表达。

转染前1 d，将密度为1×10⁵个/mL的ME-180细胞接种于6孔板中，使转染时的细胞密度保持在70%左右。用125 μL无血清无抗生素的DMEM培养基分别与3.75 μL、7.5 μL的Lipofectamine 3000混合，混匀后室温下孵育5 min，为A液；用125 μL无血清无抗生素的DMEM培养基稀释sh-ASTL，1 μg/孔sh-ASTL，混匀后孵育5 min，为B液；将A、B溶液混匀即为转染液，孵育30 min。转染时去掉6孔板中的培养基，PBS洗2~3次，每孔加入约2 mL无血清无抗生素的DMEM培养基，将孵育后的转染液加入6孔板中，轻轻摇晃混合；于37℃的CO₂恒温培养箱中培养4~6 h后换为含血清、青链霉素双抗的DMEM培养基培养^[9]。24 h 后收集细胞，检测ME-180细胞中AKT、ASTL等mRNA与靶基因的表达情况。同时，分别用0、5、10 nmoL/L的抗体处理ME-180细胞，检测抗体中和对靶基因表达情况的影响。

将700 μL/孔 Trizol试剂加入6孔板裂解细胞，提取细胞总RNA，将提取的RNA按照cDNA合成试剂盒说明书反转录生成cDNA，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）mRNA的表达量作为内参。进行qRT-PCR，分析其扩增曲线和融解曲线。扩增条件： 95℃预变性 30 s；95℃变性3 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，数据采用 2^−ΔΔCt法进行分析。 实验所需引物来源于 GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）以及miRBase（https://www.mirbase.org）数据库，通过 Primer Premier 5软件（购自美国PREMIER Biosoft公司）进行引物设计，具体序列见表1。

取5×10⁶~10×10⁶个经5 nmoL/L兔抗人ASTL抗体处理的ME-180细胞，在4℃、500×g条件下离心3 min，小心去除培养基，收集细胞。用冷PBS洗涤细胞2次。按照细胞膜蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白。细胞样品中加入200 μL冷的试剂A、 2 μL蛋白酶抑制剂混合物、2 μL蛋白稳定剂，高速涡旋振荡15 s，置冰上10 min。再次高速涡旋振荡5 s，然后在4℃、13 000×g条件下离心5 min。快速将上清转移至另一预冷的干净离心管，37℃水浴5~10 min，37℃下2 000×g离心5 min，此时溶液分为两层（对着光线看），下层相约为20 μL，收集上层相，即为细胞质蛋白。用150~200 μL冷的试剂B稀释下层相，混匀后冰浴2 min，37℃水浴10 min，37℃下22 000×g离心5 min，此时溶液分为两层（对着光线看），下层相约为20 μL，用100 μL冰冷的试剂C稀释下层相，即得细胞膜蛋白。

应用 IBM SPSS Statistics 21.0软件进行统计学分析。数据均符合正态分布、方差齐性检验后，组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

EdU染色实验结果显示，ASTL抗体组与对照组比较，差异无统计学意义（t=2.45，P>0.05），照射组（4 Gy）和ASTL抗体组与ASTL抗体+照射组（4 Gy）比较，细胞增殖的差异均有统计学意义（t=9.25、11.16，均P<0.05）（图1A）。MTT实验结果显示，与对照组相比，照射后24、48、72 h时照射组（4 Gy）和ASTL抗体组ME-180细胞增殖速度的差异均无统计学意义（t=2.16、2.33、2.57，均P>0.05； t=2.11、2.43、2.77，均P>0.05）；而与照射组相比，ASTL抗体+照射组（4 Gy）ME-180细胞的生长速度明显降低，且差异均有统计学意义（t=5.17、10.32、14.27，均P<0.05）（图1B）。在HeLa细胞的MTT实验中也得到同样的结果，与照射组相比，ASTL抗体+照射组2、4、8 Gy受照射细胞的生长受到显著抑制，差异均有统计学意义（t=4.27、9.66、15.71，均P<0.05）（图1C）。ME-180细胞的克隆形成实验结果显示，与照射组相比，ASTL抗体+照射组能够显著抑制8 Gy照射后ME-180细胞的增殖，差异有统计学意义（t=7.63，P<0.05）（图1D）。以上实验结果表明，ASTL抗体能够通过中和ASTL抑制照射后ME-180细胞的生长和增殖，初步揭示ASTL在受到照射后的ME-180细胞的生长和增殖过程中发挥了重要的调控作用。

图  1  ASTL抗体对人宫颈癌ME-180和HeLa细胞放射敏感性的影响

Figure 1.  Effect of astacin-like metalloendopeptidase antibody on radiosensitivity of human cervical cancer ME-180 and HeLa cells

免疫荧光、Western blot实验结果显示，ME-180细胞经4 Gy照射后，ASTL蛋白在ME-180细胞中的定位发生转移。照射后0 h时，标记ASTL蛋白的绿色荧光位于细胞膜；24 h后，细胞膜绿色荧光强度降低，细胞质绿色荧光强度升高；照射后48~72 h，ASTL重新定位在细胞膜上（图2A、B）。Western blot实验结果显示，ASTL抗体加入后，细胞总蛋白量下降，ASTL蛋白在细胞质与细胞膜的定位数减少，照射后24 h，ASTL蛋白在细胞质中的定位数增加，但低于照射组（图2C）。以上实验结果表明，照射后的ME-180细胞中ASTL蛋白水平上调，定位由细胞膜转移至细胞质，且发挥功能后又重新定位至细胞膜。重新定位后，ASTL蛋白量与转移前无明显差异。

图  2  4 Gy γ射线照射对ASTL蛋白在人宫颈癌ME-180细胞中定位的影响

Figure 2.  Effect of 4 Gy γ-rays on the localization of astacin-like metalloendopeptidase protein in human cervical epidermal cancer ME-180 cells

采用qRT-PCR实验检测ASTL干扰后细胞中与辐射抵抗相关的部分癌基因的表达水平变化情况，结果显示，ASTL干扰片段转入后，ME-180细胞中与肿瘤发生相关的基因表达水平下降最明显的为AKT，差异有统计学意义（t=13.94，P<0.05）（图3A）。通过Western blot实验进一步检测了ASTL对AKT信号通路中相关靶基因的调控作用，结果显示，ASTL干扰或加入ASTL抗体对辐射后ME-180细胞的AKT等靶基因的表达水平下调作用显著（图3B）。ME-180细胞接受4 Gy照射后，结果显示，与对照组相比，照射组（4 Gy）ASTL、AKT等靶基因的表达水平显著升高（图3C）。综上，ASTL抗体或sh-ASTL可通过中和ASTL抑制AKT信号通路，从而增强ME-180细胞的放射敏感性。

图  3  Sh-ASTL或ASTL抗体对人宫颈癌ME-180细胞中AKT等靶基因表达的影响

Figure 3.  Effect of Sh-ASTL or ASTL antibody on the expression of protein kinase B gene and other target genes in human cervical cancer ME-180 cells

宫颈癌的基本治疗方法为放疗和手术治疗。放疗通过能量的释放阻止细胞生长并破坏癌细胞的生物学功能，从而达到抑制肿瘤生长，使其减小甚至消失的目的^[9-10]。目前放疗已成熟应用于多种肿瘤治疗中。对于一些无法进行手术的晚期宫颈癌患者来说，放疗也能缓解疼痛，延长寿命，并提高患者生存质量^[11-12]。目前，放疗在宫颈癌的临床应用中仍存在许多问题。尤其随着放疗过程的进展，宫颈癌患者的癌细胞的放射敏感性逐渐降低，肿瘤瘤体持续快速生长，发生浸润或转移，再次降低了患者的生存质量^[13-14]。

在前期研究中，我们通过人蛋白质图谱（HPA）、癌症基因图谱（TCGA）及肿瘤芯片（Scotto Cervix）数据库获取了ASTL基因在多种临床肿瘤组织中的表达情况，其中，ASTL基因在宫颈癌中的异常表达最为显著，因此，我们选择人宫颈癌ME-180细胞作为研究对象。通过人为加入ASTL抗体中和膜蛋白ASTL，证实了ASTL抗体对ME-180细胞的放射敏感性具有影响，且随着照射剂量的增大，实验组与对照组细胞的存活与增殖情况差异愈显著。随后转入ASTL干扰片段，对ME-180细胞中与宫颈癌发生相关的基因表达变化情况进行了研究，结果显示，AKT等靶基因的表达水平下调显著。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT通路是癌症发展和治疗中最重要的激酶信号网络之一，AKT是这一通路的中心介质，其异常激活与许多恶性肿瘤有关，包括肺癌^[15]、肝细胞癌^[16]、乳腺癌^[17]、鼻咽癌^[18]和宫颈癌^[19]等。活化的AKT可参与细胞的生长和增殖^[20]，调控细胞凋亡^[21]进程，并与肿瘤的侵袭、转移和血管生成等相关，参与多种生物学进程。目前也有研究结果证实，AKT与肿瘤化疗耐药^[22]和辐射抵抗^[20]相关，特别是其参与的信号通路在辐射抵抗中起关键作用^[23]。本研究结果显示，γ射线照射后，ASTL干扰显著降低γ射线照射后ME-180细胞的存活与增殖能力，ASTL抗体的增敏作用随浓度增加而增强，并伴随AKT等靶基因的表达水平降低。这一结果提示，ASTL通过影响AKT信号通路介导宫颈癌细胞的辐射抵抗。且本研究结果发现，γ射线照射后，ASTL在细胞中的表达水平升高，并由细胞膜向细胞质转移。在今后的研究中，应进一步对照射后转移到细胞质的ASTL蛋白功能开展研究，并且采用更为多样的实验方法进行评估，深入探究其机制。

综上所述，本研究结果证实ME-180细胞的放射敏感性与ASTL的表达水平相关，且照射后细胞的ASTL、AKT表达水平升高，而人为中和ASTL后，ME-180细胞抵抗辐射的能力降低，放射敏感性显著提高。因此，随着ASTL对宫颈癌放射敏感性调控机制相关研究的深入，其或可作为治疗宫颈癌的新靶点，这具有非常重要的基础研究价值和临床意义，将为解决宫颈癌放疗中细胞辐射抵抗的难题奠定理论基础。

利益冲突　本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明　赵舒雅、李航负责实验的实施、论文的撰写；樊赛军负责课题设计的指导、论文的审阅与修改。