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在核爆炸、核泄漏和其他核辐射事故以及医疗行为中，不恰当的放射治疗或意外暴露可导致放射性事故的发生[1-2]。包括脾、肝脏、胸腺、骨髓等造血器官和血液循环系统在内的造血系统对辐射刺激高度敏感，在放射性事故所致的辐射损伤中，虽然造血系统的损伤较早发生，但危害严重[3-5]。因此，开发安全有效的辐射防护药物用于减轻射线对机体正常组织器官的损伤效应一直是放射医学领域面临的重大任务。
目前临床应用于预防或治疗辐射损伤的药物主要包括氨磷汀、某些抗氧化剂、雌激素和半胱氨酸等，这些药物在辐照前后的及时应用在一定程度上缓解了受照者的辐射损伤综合征，改善了患者的生活质量[1, 6-7]。然而，这些药物因给药方式不便、疗效有限或不良反应较大等原因严重限制了其应用。我国传统中药方剂具有在发挥药效的同时能够调理身体机能、不良反应小的特点[8]。因此，寻找有益于辐射损伤修复的中药方剂对辐射损伤救治研究具有重要意义。藿香正气合剂为中医传统方剂藿香正气散的提取液，多用于暑湿感冒、脘腹胀痛、呕吐泄泻和霍乱中暑等疾病[9]。方剂包括藿香、紫苏叶、白芷、白术、陈皮、半夏、厚朴、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、大枣和生姜等，诸药协同，化湿利水，调和脾胃，共奏脾胃运化之功[10]。然而，藿香正气合剂是否可以通过调理造血系统功能修复受照机体的急性辐射综合征有待研究。本研究旨在以受照C57BL/6J小鼠构建γ射线诱导的造血系统损伤动物模型，探究藿香正气合剂对致造血系统损伤剂量（5 Gy）的γ射线全身照射小鼠的损伤防护作用，为深入研究藿香正气合剂用作临床辐射损伤防护药物的应用提供理论基础和实验依据。
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藿香正气合剂[规格：10 mL/支×12支，国药准字Z36020544，恩威（江西）制药有限公司）]。137Cs γ射线照射源购自加拿大原子能有限公司（Autocell40）。血细胞计数仪（MEK-7222K）购于日本光电公司。
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6~8周龄，体重18~20 g的C57BL/6J雄性小鼠40只[健康无特定病原体级，许可证号：SCXK（京）2019-0008）]，购于北京华阜康生物科技有限公司。实验小鼠均饲养于中国医学科学院放射医学研究所无特定病原体级动物房屏障环境内，饲养温度18~25℃，相对湿度为40%~70%。所有小鼠饲养1周适应环境后按体重随机区组法分为正常对照组（10只）、γ射线照射组（15只）和γ射线照射+藿香正气合剂组（15只）。将2组需照射小鼠用137Cs γ射线进行一次性全身5 Gy（致造血系统损伤剂量）照射，照射剂量率为0.88 Gy/min。照射后1 h内，正常对照组和γ射线照射组分别给予200 μL饮用水、γ射线照射+藿香正气合剂组给予200 μL藿香正气合剂灌胃处理。每天14:00灌胃1次，连续灌胃10 d。
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每天记录照射及给药前后3组小鼠的体重变化，计算各组小鼠的平均体重。
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3组小鼠在摘眼球取血前称其体重，脱颈处死小鼠后分别摘取各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、大肠和胸腺等脏器，剔除粘连脂肪后称其质量，计算其脏器指数：脏器指数=脏器质量/小鼠体重。
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小鼠经眼球摘除法收集其血液约60 μL，于1.5 mL离心管中事先加入乙二胺四乙酸二钾溶液作抗凝处理，经血细胞计数仪分析小鼠血液中血常规各项指标的变化。
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采用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计学分析。计量资料符合正态分布且方差齐，以均值±标准差（
${\bar x} \pm {\rm{s}}$ ）表示，采用t检验对组间数据进行比较。P<0.05表示差异有统计学意义。 -
由图1可见，γ射线照射组和γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的平均体重均低于正常对照组，差异有统计学意义（t=2.603~4.457，P=0.000~0.007），而γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的体重高于γ射线照射组，且照射后第4、6、7、8、9、10天体重差异均有统计学意义（t=2.138~2.529，P=0.027~0.045），数据显示体重差异维持在0.5 g左右。这些实验结果表明，给小鼠灌胃服用藿香正气合剂可缓解γ射线照射导致的小鼠体重降低。
图 1 3组小鼠给药后不同时间点的体重变化
Figure 1. The body weight changes of mice in three groups at different time point after the treatment
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如图2所示，γ射线照射组和γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的心脏、肝脏、脾脏和胸腺的脏器指数均低于正常对照组，其中γ射线照射组与正常对照组之间的差异最大，且均有统计学意义（t=3.813、3.003、3.847、3.789，P=0.001、0.005、0.000、0.000），而γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠心脏、肝脏、脾脏和胸腺的脏器指数均高于γ射线照射组，差异均有统计学意义（t=1.768、1.894、2.085、1.992， P=0.022、 0.023、0.038、0.044）。以上实验结果表明，小鼠灌胃服用藿香正气合剂可缓解γ射线照射诱导的小鼠心脏、肝脏、脾脏和胸腺的脏器指数降低。
图 2 3组小鼠给药10 d后4种脏器的脏器指数
Figure 2. The coefficients of four organs in three groups after the treatment of 10 days of administration
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由图3可知，γ射线照射组和γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的脾脏和胸腺的重量均低于正常对照组，其中γ射线照射组与正常对照组之间的差异最大，且均有统计学意义（t=3.872、3.791，P=0.000、0.001），而γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的脾脏和胸腺重量均高于γ射线照射组，且差异均有统计学意义（t=2.517、2.158，P=0.028、0.029）。以上实验结果表明，给小鼠灌胃服用藿香正气合剂可缓解γ射线照射诱导的小鼠脾脏和胸腺的重量降低。
图 3 3组小鼠给药10 d后脾脏和胸腺的重量比较
Figure 3. Weight comparison of spleen and thymus in three groups of mice after 10 days of administration
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第2.2和2.3小节结果显示，经藿香正气合剂处理后小鼠的脏器指数及重量明显增加的脏器均属于造血系统，进而我们采用血细胞计数仪测定并分析了各组小鼠的血液学指标差异。由图4可知，5 Gy γ射线照射可使小鼠的血红蛋白含量、WBC和血小板数量等9项血常规指标发生明显改变，其中γ射线照射组和正常对照组之间的差异最大，且有统计学意义（t=2.982~3.201，P=0.000~0.003），而照射小鼠灌胃服用藿香正气合剂后以上指标的变化减小，减小的程度差异有统计学意义（t=2.262~3.916，P=0.000~0.005）。以上实验结果表明，小鼠灌胃服用藿香正气合剂可改善γ射线照射导致的小鼠血液学指标变化，藿香正气合剂可能通过缓解小鼠的造血系统损伤发挥辐射防护作用。
图 4 3组小鼠给药10 d后血常规各项指标的结果
Figure 4. The blood routine indexes in three groups of mice after 10 days of administration
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随着科学技术的迅猛发展，核能与核技术的应用领域不断拓展，其在给社会创造财富并给人类带来巨大便利的同时，也大大增加了人们遭受电离辐射损伤的潜在风险[11]。电离辐射作用于生物体，将造成生物体的细胞、组织、器官等的损伤，引起一系列严重的病理反应[12-13]。因此，电离辐射防护剂和治疗药物的应用备受关注，目前使用的辐射防护剂主要包括以下3种：①化学类防护剂，如氨磷汀、天然甾体激素或人工合成的非甾体激素和具有抑制炎性介质释放、改善血液微循环作用的胰蛋白酶抑制剂类药物乌司他丁等；②植物和中草药辐射防护剂，如具有清除自由基、促进造血干细胞增殖和免疫增强作用的沙棘，可通过诱导细胞凋亡、抑制脂质过氧化和细胞周期阻滞等发挥防辐射作用的白藜芦醇，以及可促进放射性物质排放和刺激白细胞和骨髓细胞增殖的螺旋藻等天然成分；③细胞因子类辐射防护剂，如造血生长因子、粒细胞集落刺激因子和IL等[14]。然而，目前已知的电离辐射防护剂往往由于其不良反应较大和疗效不太理想等而限制了其应用。
造血系统对电离辐射十分敏感，骨髓造血抑制是机体受到全身照射后的临床表现之一。电离辐射防护药物能够提高受照机体的生存质量，在一定程度上依赖于其对造血系统功能的改善作用。有研究报道显示，多种天然来源的黄酮类化合物具有明显的抗电离辐射作用，其作用机制与其对造血系统和免疫系统的保护作用有关[15]。低聚壳聚糖能减轻受照小鼠骨髓有核细胞的辐射损伤、保护有丝分裂所需的蛋白质合成、促进造血干细胞的恢复[16]。血小板因子4在小鼠全身照射前使用能够减少骨髓和淋巴组织的辐射损伤[17]。间充质干细胞可以分泌造血生长因子和重建造血微环境，且具有易于外源基因转染和表达、低免疫原性等优点，将其应用于急性电离辐射损伤的临床治疗具有十分广阔的前景[18]。因此，寻找高效、低毒的天然辐射防护剂及治疗药物是研究人员关注的热点。
中医传统方剂藿香正气中的白术、茯苓健脾运湿；生姜、大枣、甘草调和脾胃化湿；半夏、陈皮燥湿和胃，诸药合用，协同促进脾胃运化之功。因此，藿香正气合剂对机体造血系统功能的恢复具有重要作用。本研究通过对137Cs γ射线（5 Gy）全身照射小鼠的体重、造血系统主要脏器的脏器指数及重量和血常规等指标进行分析，评估了藿香正气合剂对辐射损伤的作用。在我单位长期科研实践的基础上，结合大量相关文献报道发现，大于3.5 Gy的γ射线全身照射即可导致小鼠产生严重的造血系统损伤及持续的骨髓抑制[19]，而4~6 Gy γ射线照射为用于构建造血系统损伤模型的常用剂量[20-22]，故本研究选择5 Gy 137Cs γ射线作为照射剂量。照射小鼠服用藿香正气合剂后可观察到体重明显回升，这为藿香正气合剂可以促进辐射损伤修复提供了直观提示。同时，实验数据显示，2组照射组小鼠的体重呈现先下降后上升的趋势，而在此过程中γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的体重长期维持在高于单纯照射组小鼠的体重0.5 g左右，这也反映出藿香正气合剂对照射小鼠防护作用的稳定性和可靠性。而后通过称量小鼠各主要脏器重量及计算脏器指数发现，藿香正气合剂确实提高了小鼠血液循环系统器官的脏器指数，其中对脾脏和胸腺重量的改善最为明显，进一步证明藿香正气合剂具有促进造血系统损伤修复的作用。最后对小鼠的血常规各项指标分析发现，藿香正气合剂明显改善了血红蛋白、WBC和血小板等指标，然而，结果未发现藿香正气合剂对小鼠的RBC水平及其他一些指标有改善作用，这也提示其缓解辐射损伤修复的作用有一定局限性，藿香正气合剂具体的用法以及用量等仍有待于深入研究并进行优化完善。另外，许多电离辐射防护剂发挥抗辐射损伤作用与其固有的清除自由基和抗氧化能力密切相关，据文献报道，藿香正气合剂复合成分中的广藿香[23]、紫苏叶[24]、白芷[25]、白术[26]、陈皮[27]、半夏[28]、厚朴[29]、桔梗[30]、茯苓[31]、大枣[32]和生姜[33]等各单体中药成分均具有较明确的抗氧化功能。因此我们推测，藿香正气合剂缓解小鼠辐射损伤的功能可能是通过以上各成分的抗氧化作用实现的。在今后的研究中，宜进一步采用藿香正气合剂单方的有效成分开展实验，评估其辐射防护作用，以验证上述推理的可靠性；并且采用更为详细的生理和分子生物学指标，如从造血干细胞和（或）祖细胞及造血调控因子的水平改变等角度进行评估，深入探究其机制；在实验设计方面可采用析因设计并进一步分析其中潜在的相互作用及分子机制。
综上所述，我们发现藿香正气合剂可作为一种急性电离辐射损伤的救治药物，其对机体造血功能的恢复具有明显的促进作用。然而，其抗辐射作用的具体分子机制及最佳用法和用量等仍有待于进一步的探究。同时，积极开发其他具有预防和治疗电离辐射损伤作用的中药方剂，这对于抗辐射研究具有十分重要的意义。
利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。
作者贡献声明 张书琴负责论文的设计、实验的开展实施和论文的撰写；崔明和王滨负责协助实验的操作、收集实验数据和论文的校对；樊赛军负责论文的设计、实验的指导和论文的审阅。
藿香正气合剂对γ射线照射小鼠的防护作用研究
Radioprotective effects of Huoxiang Zhengqi mixture on γ irradiation treated mice
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摘要:
目的 探讨藿香正气合剂对5 Gy γ射线照射诱导的小鼠辐射损伤的防护作用。 方法 将6~8周龄的健康无特定病原体级C57BL/6J雄性小鼠按随机区组法分为正常对照组（n=10）、γ射线照射组（n=15）和γ射线照射+藿香正气合剂组（n=15）。除正常对照组外，另2组小鼠给予5 Gy γ射线一次性全身照射后1小时内，γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠给予200 μL藿香正气合剂灌胃，对照组和单纯照射组给予200 μL 饮用水灌胃。每天给药1次，连续给药10 d，每天记录小鼠的体重变化。10 d后对小鼠进行摘眼球取血测定血常规各项指标，脱颈处死小鼠并称各脏器重量。采用t检验对组间数据进行比较。 结果 γ射线照射的2组小鼠的体重低于正常对照组小鼠，在照射后第4、6、7、8、9和10天，γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的体重均高于γ射线照射组，且差异均有统计学意义（t=2.138~2.529，P=0.027~0.045）。γ射线照射+藿香正气合剂组小鼠的心脏、肝脏、脾脏和胸腺的脏器指数均高于γ射线照射组，且差异均有统计学意义（ t=1.768、1.894、2.085、1.992，P= 0.022、 0.023、0.038、0.044）。γ射线照射+藿香正气合剂组与γ射线照射组小鼠的脾脏和胸腺重量的差异最大，且均有统计学意义（t=2.517、2.158，P=0.028、0.029）。3组小鼠血液中血红蛋白浓度、白细胞数量和血小板数量等多项血常规指标之间有差异，且均有统计学意义（t=2.262~3.916，P=0.000~0.005 ）。 结论 藿香正气合剂能减缓5 Gy γ射线照射诱导的小鼠体重降低和造血系统损伤，且有一定的辐射防护作用。 Abstract:Objective To explore the in vivo effects of Huoxiang Zhengqi mixture on radiation injury induced by 5 Gy γ irradiation in mice. Methods Male 6- to 8-week-old C57BL/6J mice at specific pathogen-free level were randomly categorized into the three following groups according to body mass: normal control (NC, n=10), ionizing radiation (IR, n=15), and IR+Huoxiang Zhengqi mixture groups (I+H, n =15). Except for the NC group, the two other groups were treated with single total body 5 Gy γ irradiation. All three groups receive gavage administration of 200 μL of either Huoxiang Zhengqi mixture (I+H group) or drinking water (NC and IR groups) within 1 h after irradiation.The administration was performed once a day for 10 days. Body weight was also measured. After the treatment period, blood was extracted from the eyeball and collected into heparin-treated tubes to examine routine blood indices before the mice were sacrificed from the neck. Major organ weights were measured, and organ coefficients were analyzed. Independent sample t test was used for the intergroup comparison. Results The body weights of the IR and I+H groups were lower than those in the NC group, and yet on the fourth, sixth, seventh, eighth, ninth and tenth days after irradiation, the body weights of the I+H group were higher than those in the IR group (t=2.138–2.529, P=0.027–0.045). The organ coefficients of heart, liver, thymus, and spleen in the I+H group were higher than those in the IR group, and the differences were statistically significant (t=1.768, 1.894, 2.085, 1.992; P=0.022,0.023,0.038,0.044). The differences in the spleen and thymus weights between the IR and I+H groups were significant (t=2.517, 2.158; P=0.025, 0.029). Multiple blood indices such as hemoglobin, white blood cell count, and blood platelet between each group were significantly different (t=2.262–3.916, P=0.000–0.005). Conclusions Huoxiang Zhengqi mixture can alleviate the weight loss and hematopoietic system damage of mice induced by γ-ray irradiation (5 Gy), and exert certain radiation protection function. -
Key words:
- Gamma rays /
- Hemopoietic system /
- Radiation injuries /
- Radiation protection /
- Huoxiang Zhengqi mixture
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图 1 3组小鼠给药后不同时间点的体重变化
Figure 1. The body weight changes of mice in three groups at different time point after the treatment
图 2 3组小鼠给药10 d后4种脏器的脏器指数
Figure 2. The coefficients of four organs in three groups after the treatment of 10 days of administration
图 3 3组小鼠给药10 d后脾脏和胸腺的重量比较
Figure 3. Weight comparison of spleen and thymus in three groups of mice after 10 days of administration
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