姜黄素对非小细胞肺癌细胞A549和H460放射敏感性的影响

张书琴 崔明 肖惠文 樊赛军

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姜黄素对非小细胞肺癌细胞A549和H460放射敏感性的影响

    通讯作者: 樊赛军, fansaijun@irm-cams.ac.cn

Effects of curcumin on the radiosensitivity of non-small cell lung cancer A549 and H460 cells

    Corresponding author: Saijun Fan, fansaijun@irm-cams.ac.cn
  • 摘要: 目的 探讨姜黄素对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549和H460放射敏感性的影响,并探索长链非编码RNA(lncRNA)同源异型盒基因转录的反义基因间RNA(HOTAIR)在其中的调节机制。 方法 将培养的NSCLC细胞A549和H460根据处理方法的不同,采用4种方式进行分组。(1)分别将NSCLC细胞A549和H460分为6组:0、15、30、60、120和240 μmol/L姜黄素组,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞的增殖活力;(2)分别将NSCLC细胞A549和H460分为8组:0、2、4、6 Gy γ射线照射组及其与30 μmol/L姜黄素联合组,采用CCK-8实验和平板克隆形成实验检测各组细胞的增殖活力;(3)将NSCLC细胞A549分为4组:空白对照组、30 μmol/L姜黄素组、4 Gy γ射线照射组和30 μmol/L姜黄素+4 Gy γ射线照射联合组,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测各组细胞中5种促癌lncRNA和5种抑癌lncRNA的表达情况;(4)将NSCLC细胞A549分为6组:空白对照组、30 μmol/L姜黄素组、30 μmol/L姜黄素+lncRNA HOTAIR过表达组、4 Gy γ射线照射组、4 Gy γ射线照射+30 μmol/L姜黄素联合组和4 Gy γ射线照射+30 μmol/L姜黄素+lncRNA HOTAIR过表达组,采用CCK-8实验和平板克隆形成实验检测各组细胞的增殖活力。采用学生t检验进行统计学分析。 结果 (1)CCK-8实验结果显示,不同浓度的姜黄素处理可以剂量和时间依赖的方式降低NSCLC细胞A549和H460的增殖活力,且除了15 μmol/L姜黄素作用24 h之外,其余浓度和时间的姜黄素组与对照组相比,差异有统计学意义(t=3.884~5.731,P=0.000~0.043)。(2)CCK-8实验和克隆形成实验结果显示,30 μmol/L姜黄素+不同剂量的γ射线照射联合处理可使γ射线照射单独处理下的NSCLC细胞A549和H460的增殖活力和克隆形成能力进一步降低,差异有统计学意义(t=2.503~12.418,P=0.000~0.044)。(3)qRT-PCR实验结果显示,与空白对照组相比,lncRNA HOTAIR在γ射线单独处理后表达升高(t=3.317,P=0.040),而30 μmol/L姜黄素单独处理和30 μmol/L姜黄素+4 Gy γ射线联合处理均可下调A549细胞中促癌lncRNA HOTAIR的表达(t=3.205、5.916,P=0.038、0.000)。(4)对HOTAIR进行过表达处理,可消除姜黄素对NSCLC细胞A549增殖的抑制并增强其放射敏感性(t=3.584~5.802,P=0.000~0.004)。 结论 姜黄素可以通过下调促癌lncRNA HOTAIR的表达从而抑制NSCLC细胞的增殖活力,并增强其放射敏感性。
  • 图 1  不同浓度姜黄素处理非小细胞肺癌细胞A549(A)和H460(B)在不同时间点的细胞增殖活力

    Figure 1.  Cell viabilities of non-small cell lung cancer A549 (A) and H460 (B) cells at different time points after the treatment of different curcumin doses

    图 2  8组非小细胞肺癌细胞A549和H460在不同时间点的放射敏感性(A~B)、克隆形成能力(C~D)和克隆形成率(E~F)

    Figure 2.  Radiosensitivity (A and B), colony formation (C and D) and the colony formation efficiency (E and F) of non-small cell lung cancer A549 and H460 cells at different times in eight groups

    图 3  4组非小细胞肺癌细胞A549中促癌lncRNA(A)和抑癌lncRNA(B)的表达水平

    Figure 3.  Expression of five tumor-promoting lncRNAs(HOTAIR,CCAT2,MALAT1,H19 and SCAL1)(A)and five tumor-suppressive lncRNAs(TUG1,MEG-3,SPRY4-IT1,GAS6-AS1 and BANCR)(B)in four groups of non-small cell lung cancer A549 cells

    图 4  6组非小细胞肺癌细胞A549在不同时间点的放射敏感性(A)、克隆形成能力(B)和克隆形成率(C)

    Figure 4.  Radiosensitivity(A),colony formation(B)and the colony formation efficiency(C)of non-small cell lung cancer A549 cells at different times in six groups

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-04
  • 刊出日期:  2020-03-01

姜黄素对非小细胞肺癌细胞A549和H460放射敏感性的影响

    通讯作者: 樊赛军, fansaijun@irm-cams.ac.cn
  • 中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所,天津市放射医学与分子核医学重点实验室 300192

摘要:  目的 探讨姜黄素对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549和H460放射敏感性的影响,并探索长链非编码RNA(lncRNA)同源异型盒基因转录的反义基因间RNA(HOTAIR)在其中的调节机制。 方法 将培养的NSCLC细胞A549和H460根据处理方法的不同,采用4种方式进行分组。(1)分别将NSCLC细胞A549和H460分为6组:0、15、30、60、120和240 μmol/L姜黄素组,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞的增殖活力;(2)分别将NSCLC细胞A549和H460分为8组:0、2、4、6 Gy γ射线照射组及其与30 μmol/L姜黄素联合组,采用CCK-8实验和平板克隆形成实验检测各组细胞的增殖活力;(3)将NSCLC细胞A549分为4组:空白对照组、30 μmol/L姜黄素组、4 Gy γ射线照射组和30 μmol/L姜黄素+4 Gy γ射线照射联合组,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测各组细胞中5种促癌lncRNA和5种抑癌lncRNA的表达情况;(4)将NSCLC细胞A549分为6组:空白对照组、30 μmol/L姜黄素组、30 μmol/L姜黄素+lncRNA HOTAIR过表达组、4 Gy γ射线照射组、4 Gy γ射线照射+30 μmol/L姜黄素联合组和4 Gy γ射线照射+30 μmol/L姜黄素+lncRNA HOTAIR过表达组,采用CCK-8实验和平板克隆形成实验检测各组细胞的增殖活力。采用学生t检验进行统计学分析。 结果 (1)CCK-8实验结果显示,不同浓度的姜黄素处理可以剂量和时间依赖的方式降低NSCLC细胞A549和H460的增殖活力,且除了15 μmol/L姜黄素作用24 h之外,其余浓度和时间的姜黄素组与对照组相比,差异有统计学意义(t=3.884~5.731,P=0.000~0.043)。(2)CCK-8实验和克隆形成实验结果显示,30 μmol/L姜黄素+不同剂量的γ射线照射联合处理可使γ射线照射单独处理下的NSCLC细胞A549和H460的增殖活力和克隆形成能力进一步降低,差异有统计学意义(t=2.503~12.418,P=0.000~0.044)。(3)qRT-PCR实验结果显示,与空白对照组相比,lncRNA HOTAIR在γ射线单独处理后表达升高(t=3.317,P=0.040),而30 μmol/L姜黄素单独处理和30 μmol/L姜黄素+4 Gy γ射线联合处理均可下调A549细胞中促癌lncRNA HOTAIR的表达(t=3.205、5.916,P=0.038、0.000)。(4)对HOTAIR进行过表达处理,可消除姜黄素对NSCLC细胞A549增殖的抑制并增强其放射敏感性(t=3.584~5.802,P=0.000~0.004)。 结论 姜黄素可以通过下调促癌lncRNA HOTAIR的表达从而抑制NSCLC细胞的增殖活力,并增强其放射敏感性。

English Abstract

  • 肺癌是全球范围内影响人类健康的第一大恶性肿瘤[1]。肺癌的组织学亚型主要包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cacer, NSCLC)和小细胞肺癌,分别占肺癌的85%和15%,其中NSCLC包括鳞癌、腺癌和大细胞癌[2]。放疗是利用一种或多种高能量电离辐射对恶性肿瘤患者进行的治疗,通过能量的释放阻止细胞生长和破坏癌细胞的正常功能,达到使肿瘤缩小甚至消失的目的[3-4]。放疗是肺癌综合治疗中的一个主要手段,在国际上已被广泛研究和应用[4]。但是,由于肺癌细胞的放射抵抗作用,需要提高照射剂量,这将给患者带来严重的不良反应和并发症,严重影响肺癌患者的放疗效果和生存质量。因此,有效地提高肺癌细胞的放射敏感性,从而提升患者的放疗效果和治愈率是近年来肺癌治疗研究的热点之一。

    姜黄素是从姜科植物姜黄(Curcuma longa L.)中提取的一种相对分子质量较小的多酚类物质,通常认为它是姜黄中的最有效成分。研究结果证明,姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基、抗微生物的作用,对心血管和消化系统等也具有药理作用[5]。研究结果显示,姜黄素单独使用或与其他药剂联合使用可对多种肿瘤发挥预防或治疗作用,包括结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤和口腔癌等[6]。在肺癌中,姜黄素可通过抑制Wnt/β-catenin、Sonic Hedgehog通路和靶向表皮生长因子受体等对肺癌的发展起到阻抑作用[7-8]。然而,关于姜黄素通过调控长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)提高NSCLC放射敏感性的研究尚未见报道。

    lncRNA是一类长度为200~100 000个核苷酸、缺少特异且完整的开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA分子[9-10]。同源异型盒基因转录的反义基因间RNA(homeotic complex gene anti-sense intergenic RNA,HOTAIR)是一个长度为2158个核苷酸的反义非编码RNA,该lncRNA由同源异型盒基因C位点转录,作为“脚手架”分子可以通过其5′端募集染色质重构复合体2,并将其定位到同源异型盒基因D位点,从而抑制该位点的转录[11-12]。HOTAIR在乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤中发挥调控功能,对肿瘤的发生发展及患者的预后和生存质量等具有重要影响[13-14]。然而,HOTAIR在介导姜黄素调控肺癌放射敏感性中的作用尚未见报道。

    本研究选用NSCLC细胞A549和H460为模型,研究姜黄素对NSCLC放射敏感性的影响,并探索lncRNA在其中的调节机制,为姜黄素作为NSCLC放射增敏剂的应用并阐明其中的分子机制提供新的实验依据,并为探索肺癌的放射增敏新途径提供理论基础。

    • 姜黄素购自美国Sigma-Aldrich公司,用无水乙醇配制成6 mmol/L溶液并于−20℃储存,使用时稀释至相应浓度;细胞计数试剂盒8(cell-counting kit-8,CCK-8)和结晶紫染料购自北京索莱宝生物科技有限公司;转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司;Opti-MEM(减血清培养基)购自美国Gibco公司;Real-Time PCR试剂盒购自瑞士罗氏公司。Autocell40 137Cs γ射线照射源购自加拿大原子能有限公司。pcDNA3.1-HOTAIR过表达载体为本实验室构建。RT-6500酶标分析仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。

    • 人类NSCLC细胞A549和H460购自美国模式培养物集存库细胞库,采用含10%胎牛血清的1640培养液于含5% CO2的37℃恒温培养箱中培养,待细胞生长浓度达到约80%时进行传代亚培养。选择处于对数生长期的肿瘤细胞进行实验。根据处理方法的不同,采用4种方式进行分组。(1)将NSCLC细胞A549和H460分为6组:0、15、30、60、120和240 μmol/L姜黄素组;(2)根据(1)中的实验结果选取较低有效处理浓度(30 μmol/L)的姜黄素用于后续实验研究,将NSCLC细胞A549和H460分为8组:0、2、4、6 Gy γ射线照射组及其分别与30 μmol/L姜黄素联合组;(3)将NSCLC细胞A549分为4组:空白对照组、30 μmol/L姜黄素组、4 Gy γ射线照射组和30 μmol/L姜黄素+4 Gy γ射线照射联合组;(4)将NSCLC细胞A549分为6组:空白对照组、30 μmol/L姜黄素组、30 μmol/L姜黄素+lncRNA HOTAIR过表达组、4 Gy γ射线照射组、4 Gy γ射线照射+30 μmol/L姜黄素联合组和4 Gy γ射线照射+30 μmol/L姜黄素+lncRNA HOTAIR过表达组。姜黄素组的细胞经姜黄素处理26 h;联合组的细胞在γ射线照射前经姜黄素预处理2 h,照射后继续经姜黄素处理24 h。采用137Cs γ射线照射源照射,照射剂量率为0.88 Gy/min。

    • 转染前1 d,将1.2×106个NSCLC细胞A549接种于六孔板中,每孔加入约2 mL无抗生素培养基,使转染时的细胞密度能够达到六孔板面积的50%。取2 μL/孔Lipofectamine 3000与50 μL Opti-MEM混匀后室温孵育5 min;取2 μg pcDNA3.1-HOTAIR过表达载体与50 μL Opti-MEM混匀后室温孵育5 min。将以上2步所得溶液混匀,室温放置30 min,即得到转染液。将转染液加入含有细胞及培养液的孔中,轻轻摇晃孔板混合;在37℃的CO2培养箱中培养6 h后将培养基换成含血清的完全培养基。

    • 在照射前对细胞进行不同浓度的姜黄素预处理2 h,照射过程及照射后细胞均处于含此浓度姜黄素的培养基中。将经过不同处理的NSCLC细胞A549和H460按100 μL/孔铺于96孔板中,置于细胞培养箱中进行培养。分别在0、24、48、72 h时向每孔加入10 μL CCK-8溶液,注意不要产生气泡。将96孔板重新置于细胞培养箱中培养1 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

    • NSCLC细胞A549和H460经姜黄素处理、瞬时转染或不同剂量γ射线照射后,按1000个/孔铺于六孔板中。细胞连续培养2周后用甲醇固定15 min,结晶紫染液染色30 min后经自来水冲洗,对每孔克隆形成情况进行拍照记录,统计各实验组的克隆形成率并绘制细胞存活曲线。

    • 收集细胞,采用TRIzol裂解法提取细胞RNA,反转录获得cDNA,检测各lncRNA的表达,包括:HOTAIR、结肠癌相关转录本2(colon cancer-associated transcript 2,CCAT2)、肺癌转移相关转录本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)、肝脏19(hepatic 19,H19)、吸烟和癌症相关的长链非编码RNA1(smoke and cancer associated lncRNA 1,SCAL1)、牛磺酸上调基因1(taurine upregulated gene 1,TUG1)、母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG-3)、快速发育生长因子同源蛋白RTK信号拮抗剂4-内含子转录本1(sprouty RTK signaling antagonist 4-intronic transcript 1,SPRY4-IT1)、生长停滞特异性基因产物6-反义RNA 1(growth arrest-specific gene 6-antisense RNA 1,GAS6-AS1)、B-Raf激活的非编码RNA(BRAF-activated non-protein coding RNA,BANCR),同时检测肌动蛋白(Actin) mRNA的表达作为内参。扩增条件:50℃预处理2 min、95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃退火1 min,循环40次,数据采用2−ΔΔCt法进行分析。各lncRNA的引物序列如下。

      Actin引物序列:

      正向5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′;

      反向5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′;

      HOTAIR引物序列:

      正向5′-GGCAAATGTCAGAGGGTTCT-3′;

      反向5′-CTTAAATTGGGCTGGGTCTAC-3′;

      CCAT2引物序列:

      正向5′-AGACAGTGCCAGCCAACC-3′;

      反向5′-TGCCAAACCCTTCCCTTA-3′;

      MALAT1引物序列:

      正向5′-GAATTGCGTCATTTAAAGCCTAG-3′;

      反向5′-GTTTCATCCTACCACTCCCAATT-3′;

      H19引物序列:

      正向5′-CTGGGAGGGTGTCTGCTTC-3′;

      反向5′-CTGGGCAACGGAGGTGTA-3′;

      SCAL1引物序列:

      正向5′- ACCAGCTGTCCCTCAGTGTTCT -3′;

      反向5′- AGGCCTTTATCCTCGGGTTGCCT -3′;

      TUG1引物序列:

      正向5′- TAGCAGTTCCCCAATCCTTG -3′;

      反向5′- CACAAATTCCCATCATTCCC -3′;

      MEG-3引物序列:

      正向5′- CCTCTCCATGCTGAGCTGCT -3′;

      反向5′- TGTTGGTGGGATCCAGGAAA -3′;

      SPRY4-IT1引物序列:

      正向5′- AGCCACATAAATTCAGCAGA -3′;

      反向5′- CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA -3′;

      GAS6-AS1引物序列:

      正向5′- GTGGGTACTGCATTCCTACCG -3′;

      反向5′- CTCTCCTCTGATGGCAGGAC -3′;

      BANCR引物序列:

      正向5′- CCTTCTTGTAGGGTCTGGATTG -3′;

      反向5′- CATTGGTGCTGCAGTCTATTTC -3′。

    • 应用IBM SPSS Statistics 21软件进行统计学分析。原始数据符合正态分布且方差齐,以均数±标准差($ \bar x$±s)表示,多组间数据两两比较采用学生t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

    • CCK-8实验结果显示,15、30、60、120 μmol/L和240 μmol/L的姜黄素组以剂量和时间依赖的方式抑制NSCLC细胞A549(图1中A)和H460(图1中B)的增殖活力,且除了15 μmol/L姜黄素作用24 h之外,其余浓度和时间的姜黄素组与对照组(0 μmol/L)相比,差异均有统计学意义(t=3.884~5.731,P=0.000~0.043)。这一结果表明,姜黄素可在体外细胞水平抑制NSCLC细胞的增殖。

      图  1  不同浓度姜黄素处理非小细胞肺癌细胞A549(A)和H460(B)在不同时间点的细胞增殖活力

      Figure 1.  Cell viabilities of non-small cell lung cancer A549 (A) and H460 (B) cells at different time points after the treatment of different curcumin doses

    • CCK-8实验结果显示,30 μmol/L的姜黄素分别与0、2、4、6 Gy γ射线照射联合处理均可增强各照射剂量单独处理对NSCLC细胞A549(图2中A)和H460(图2中B)增殖的抑制作用,且差异有统计学意义(t=2.503~5.792,P=0.000~0.044)。平板克隆形成实验进一步验证,上述30 μmol/L姜黄素与γ射线照射联合处理可增强单独照射对A549和H460细胞的克隆形成能力的抑制作用(图2中C和D)。对两株细胞系的克隆形成率进行统计分析,结果发现各剂量的γ射线照射与30 μmol/L姜黄素联合处理后,细胞的克隆形成能力以剂量依赖的方式进一步降低(图2中E和F),且差异有统计学意义(t=3.745~12.418,P=0.000~0.016)。以上结果表明,30 μmol/L的姜黄素可在体外细胞水平增强NSCLC细胞的放射敏感性。

      图  2  8组非小细胞肺癌细胞A549和H460在不同时间点的放射敏感性(A~B)、克隆形成能力(C~D)和克隆形成率(E~F)

      Figure 2.  Radiosensitivity (A and B), colony formation (C and D) and the colony formation efficiency (E and F) of non-small cell lung cancer A549 and H460 cells at different times in eight groups

    • 图3可见,促癌lncRNA HOTAIR在γ射线照射单独处理后表达升高,而在30 μmol/L姜黄素单独处理或与4 Gy γ射线照射联合处理后表达下降,且联合处理组较姜黄素单独处理组的降低程度更高,差异有统计学意义(t=3.205、3.317、5.916,P<0.05、<0.05、<0.01)(图3中A);抑癌lncRNA TUG1的表达趋势与lncRNA HOTAIR相反(图3中B)。而其余促癌和抑癌lncRNA的表达趋势与功能实验的结果不吻合。以上结果表明,姜黄素可通过下调促癌lncRNA HOTAIR和上调抑癌lncRNA TUG1的表达增强NSCLC细胞的放射敏感性。本研究首先锁定促癌lncRNA HOTAIR为靶点进行研究。

      图  3  4组非小细胞肺癌细胞A549中促癌lncRNA(A)和抑癌lncRNA(B)的表达水平

      Figure 3.  Expression of five tumor-promoting lncRNAs(HOTAIR,CCAT2,MALAT1,H19 and SCAL1)(A)and five tumor-suppressive lncRNAs(TUG1,MEG-3,SPRY4-IT1,GAS6-AS1 and BANCR)(B)in four groups of non-small cell lung cancer A549 cells

    • CCK-8实验结果显示,30 μmol/L姜黄素处理可降低A549细胞的增殖活力,而过表达HOTAIR可使A549细胞的增殖活力得以回升;30 μmol/L姜黄素处理可使4 Gy γ射线照射单独处理的A549细胞的增殖活力进一步降低,而过表达HOTAIR同样可使γ射线照射单独处理的A549细胞的增殖活力得以回升(图4中A)。平板克隆形成实验及对克隆形成率进行统计的结果显示,过表达HOTAIR对姜黄素和γ射线照射单独或联合处理A549细胞克隆形成能力的影响与上述趋势一致(图4中B和C)。以上结果表明,过表达HOTAIR可消除姜黄素对NSCLC细胞增殖的抑制作用,并能够进一步消除姜黄素增强NSCLC细胞放射敏感性的作用。姜黄素可通过下调促癌lncRNA HOTAIR的表达增强NSCLC细胞的放射敏感性。

      图  4  6组非小细胞肺癌细胞A549在不同时间点的放射敏感性(A)、克隆形成能力(B)和克隆形成率(C)

      Figure 4.  Radiosensitivity(A),colony formation(B)and the colony formation efficiency(C)of non-small cell lung cancer A549 cells at different times in six groups

    • 肺癌是全球男性肿瘤患者的首位病死原因,也是在我国发病率和病死率均居首位的恶性肿瘤[15]。随着放射生物学、功能影像和计算机技术的不断发展,放疗在NSCLC的治疗中展现出显著优势[15-16]。但许多中、晚期肺癌患者往往对放疗不敏感,使治疗效果大大降低[17]。因此,有效地增加肺癌细胞的放疗敏感性,减少治疗中对正常组织的放射损伤,从而提升患者的放疗效果和治愈率是近年来肺癌治疗研究的热点之一。

      本研究在确定姜黄素可以抑制NSCLC细胞A549和H460增殖的基础上发现其可以增强NSCLC的放射敏感性。lncRNA是近年来被广泛关注的新型生物大分子,在多种生命活动和疾病的发生发展中发挥着重要调节作用。多项研究表明,lncRNA分子的异常表达与肿瘤的恶性表型密切相关[18]。因此,我们通过查阅文献分别筛选了5种在NSCLC中发挥重要促癌或抑癌功能的lncRNA分子,分别是促癌lncRNA:HOTAIR、CCAT2、MALAT1、H19、SCAL1;抑癌lncRNA:TUG1、MEG-3、SPRY4-IT1、GAS6-AS1、BANCR。经查阅文献发现,A549细胞对137Cs γ射线的辐射抗性强于H460细胞[19],考虑到应选择辐射抗性更强的细胞开展辐射增敏作用研究的意义更重要,我们选取A549细胞并进一步采用实时定量PCR方法检测了上述lncRNA分子在单独γ射线照射或联合姜黄素处理后的表达水平。经筛选首先锁定了HOTAIR为姜黄素发挥辐射增敏作用的靶点。随后,将HOTAIR进行过表达,抑制姜黄素对NSCLC细胞增殖的抑制作用和增强放射敏感性的作用,最终得到了姜黄素通过下调促癌lncRNA HOTAIR的表达增强NSCLC放射敏感性的结论。但是本研究只是简单探究了lncRNA HOTAIR介导姜黄素对NSCLC的辐射增敏作用的调节机制,关于HOTAIR为姜黄素的直接还是间接作用靶点,以及详细的上下游机制是什么,仍有待后续探究。另有文献报道,lncRNA HOTAIR可增强宫颈癌[20]、乳腺癌[21]、结直肠癌[22]和食管癌[23]的辐射抵抗能力,由此推测可能A549细胞相对于H460细胞对137Cs γ射线更高的辐射抗性与该细胞内较高的HOTAIR水平(本研究未在实验水平探究,有待后续研究证实)有关,且后续发现在A549细胞中HOTAIR确实介导了姜黄素对NSCLC的辐射增敏作用。这也进一步证明了我们的细胞株选择和研究结论的正确性。

      有研究结果显示,姜黄素可通过抑制Wnt/β-catenin和Sonic Hedgehog通路抑制肺癌干细胞[7];可通过靶向表皮生长因子受体用于肺癌治疗[8];可通过miRNA-98、p53-miR-192-5p/215-XIAP通路、miR-21、MiR-186等miRNA调控网络发挥抑制肺癌的作用[24-30];可通过抑制自噬和诱导凋亡抑制非小细胞肺癌的发展[31-32]。本研究结果发现,姜黄素可在体外细胞水平抑制NSCLC细胞的增殖,并增强其放射敏感性,这与之前的研究结果[7-8, 24-32]一致,并进一步验证了姜黄素在抗肺癌方面的作用。

      HOTAIR通过多种生物学作用方式调控其他基因的表达,可在编码蛋白基因的上游启动子区转录,从而干扰邻近蛋白编码基因的表达;与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,在Dicer酶作用下产生内源性的小干扰RNA,调控基因的表达,同时也可干扰mRNA的剪切,产生不同的剪切形式;可结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性;作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合物或改变该蛋白的胞内定位[33-34]。通过这些方式,HOTAIR在乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤中发挥调控功能,对肿瘤的发生发展及患者的预后和生存质量等具有重要影响[13-14]。本研究结果显示,具有促癌功能的lncRNA HOTAIR在γ射线照射后呈现辐射抵抗作用,而姜黄素可以抑制HOTAIR的辐射抵抗作用,从而增强NSCLC细胞对γ射线的放射敏感性。鉴于本研究中发现姜黄素是通过下调lncRNA HOTAIR的表达抑制NSCLC的增殖并增强其放射敏感性的,因而需将HOTAIR进行转染过表达后检测是否可以逆转消除姜黄素的这种抑制和放射增敏作用,从而进一步证明上述调节机制,研究结果也验证了姜黄素通过下调促癌lncRNA HOTAIR的表达增强NSCLC放射敏感性的结论。“安全、有效、质量可控”为药品开发过程中需严格把控的三原则,其中安全、对人体正常组织细胞的不良作用小是药品开发的前提[35]。有研究报道,姜黄素具有对多种肿瘤细胞放射增敏和对正常组织器官的辐射损伤保护的双向作用[36],其中,放射增敏效果主要是通过抑制放射激活的NF-κB信号通路、诱导G2/M期阻滞、引起电离辐射后肿瘤细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平升高等途径实现的[36]。Lee等[37]发现,姜黄素对正常肺组织具有辐射损伤保护作用,但却能够增加体内外肺癌细胞的放射敏感性;另有研究证实,在对肿瘤放射增敏起效浓度下,姜黄素对正常组织细胞并没有明显不良反应[38]。这些研究结果表明,姜黄素满足了临床对放射增敏药物的两大要求,即既无明显不良作用,又可选择性增加肿瘤细胞对放射的敏感性,这为将姜黄素开发成良好的肿瘤放射增敏候选药物提供了有力支撑。然而,药物的有效性既包括体外细胞水平,还包括体内动物水平及最终的临床人体水平,且后两者更为重要。本研究仅初步探索了姜黄素对体外NSCLC放射增敏的作用及lncRNA HOTAIR在其中的调控机制,且目前证实姜黄素具有放射增敏作用的研究多为体外细胞水平的结果,体内动物水平的研究仍十分缺乏。关于姜黄素能否在体内动物水平和临床肿瘤患者中表现出与体外细胞水平相同的双向作用,姜黄素对肿瘤细胞和正常组织细胞发挥不同作用的具体调节机制是什么,以及姜黄素作为放射增敏剂的最佳用量和使用方案等关键问题,仍需进一步研究探讨。

      如上所述,姜黄素可通过上调肿瘤细胞内部ROS水平发挥放射增敏作用,同时γ射线照射会通过使肿瘤细胞内部ROS水平升高而引起核酸双链或单链断裂,从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。因此,两者联合使用时所检测到的lncRNA的表达水平在各组中最低,可能的原因是两者联合作用导致细胞内ROS的过度累积引起了细胞内过高程度的核酸断裂,其中包括HOTAIR的断裂。姜黄素可通过下调suvivinc-myc、血管内皮生长因子和cyclin D1等癌基因的表达发挥放射增敏作用[36]。与此类癌基因相同,具有促癌作用的lncRNA HOTAIR可被姜黄素下调从而介导姜黄素对NSCLC的放射增敏作用。而在γ射线照射后HOTAIR表达的升高可能是由于具有促癌作用的HOTAIR在经照射刺激后产生了辐射抵抗所致。

      综上所述,深入研究姜黄素作为肺癌细胞放射增敏剂的应用具有非常重要的临床意义和价值,lncRNA HOTAIR可以作为肺癌治疗的新靶点。今后应进一步从分子生物学和放射生物学角度深入探讨姜黄素通过lncRNA HOTAIR发挥作用的具体分子机制,并加强关注姜黄素对正常肺上皮细胞放射生物学效应的影响。本研究为NSCLC的放射增敏提供了新的实验依据,也为临床肺癌放疗效果的提高奠定了基础。

      利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展,不涉及任何利益冲突

      作者贡献声明 张书琴负责课题的设计、相关实验的操作、论文的撰写;崔明、肖惠文负责协助进行实验的操作、数据的收集、论文的校对;樊赛军负责实验的指导、论文的审阅。

参考文献 (38)

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