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以X射线为代表的光子射线在现代医学影像学检查与肿瘤治疗中有着不可替代的作用[1],包括CT、数字化X射线成像在内的多种影像学检查已成为各种胸部、纵膈、心血管疾病以及介入治疗中最常用的辅助检查手段。值得注意的是:一方面,随之而来的正常组织射线暴露风险近年来也被广泛关注[2];另一方面,放疗是肺癌及纵膈肿瘤、淋巴瘤的重要治疗手段之一。放射性肺损伤(radiation-induced lung injury, RILI)是胸部放疗的常见并发症,也是限制肿瘤根治剂量的关键因素之一[3-4]。肺部作为辐射敏感器官,经电离射线作用后可能引起放射性肺炎及肺纤维化等并发症[5-6]。
目前,临床上或辐射防护领域仍然缺乏有效监测与评价RILI晚期改变的分子生物学标志物。当前对放射性肺炎或合并肺纤维化疾病的诊断主要依赖于临床生化指标、影像学以及肺功能等检查手段。受肺部的代偿功能影响,这些常规检查往往在灵敏度、特异度方面相对不足,而且结果容易出现滞后性,尚不能及时、准确地反映晚期慢性肺部病理生理学改变。纤维支气管镜结合有效基因标志物检查可显著提高早期辐射相关肺损伤的检出率,从而为肺损伤相关疾病的精准诊疗提供有力证据。此外,RILI小鼠模型因其与人类有极为相似的慢性炎症和纤维发生改变特征,是研究放射性肺部不良反应、特发性肺纤维化等疑难疾病机制的理想模型。本研究基于不同剂量X射线全肺野照射晚期小鼠肺组织,使用全基因组芯片研究辐射相关的差异表达基因,结合信号通路富集分析探讨RILI潜在的基因标志物,并进行数学建模来预测与提示放射性肺疾病的发生、发展程度。
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不同剂量X射线照射后小鼠肺组织基因芯片的分析结果显示,MD组出现125个显著差异表达基因,其中32个基因表达上调、93个基因表达下调(图1中A、C、D)。HD组接受单次照射后,基因表达差异表现更为明显,共出现414个显著差异表达基因,其中263个基因表达上调、151个基因表达下调(图1中B、E、F)。
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对MD组、HD组小鼠已筛选出的差异表达基因进行韦恩图分析,结果发现有13个共同差异表达基因(图2中A)。选取其中差异性表达最显著的5个基因作为RILI潜在特征性基因标志物,包括3个显著上调基因[PH同源域家族A成员3(pleckstrin homology like domain family A member 3,Phlda3)、纤维蛋白原γ链(fibrinogen gamma chain,Fgg)、激肽原1(kininogen 1,Kng1)]和2个下调基因[蛋白质酪氨酸磷酸酶,B型受体(protein tyrosine phosphatase, receptor type B,Ptprb),KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase,Kit)](表1)。该基因标志物组合在不同剂量照射组的表达趋势差异明显(图2中B−C)。选取其中两个上调基因进行蛋白质组学验证后结果显示,HD组相比对照组Fgg 、Kng1的表达差异倍数上升约为2倍左右(图2中D)。
图 2 MD组和HD组共同差异表达基因分析结果
Figure 2. Analysis of common difference genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups
基因名称 表达 MD组 HD组 基因功能 log2(FC) P值 log2(FC) P值 PH同源域家族A成员3 上调 1.02 0.000 1.36 0.000 作为p53的直接靶点,抑制Akt蛋白活性,增强细胞凋亡。 纤维蛋白原γ链 上调 1.12 0.000 2.04 0.004 通过增强血小板P-选择素表达,在炎症、血栓形成和止血过程中发挥作用。 激肽原1 上调 1.69 0.000 3.91 0.000 具有激肽原生理功能,促进炎症因子释放、抑制血小板聚集。 蛋白质酪氨酸磷酸酶,B型受体 下调 −1.30 0.000 −1.32 0.000 在血管生成和血管重塑过程中发挥重要作用。 KIT原癌基因受体酪氨酸激酶 下调 −1.30 0.000 −1.32 0.000 通过磷酸化PIK3R1激活AKT1信号通路,抑制细胞凋亡。 注:表中,MD组:10 Gy 单次照射;HD组:20 Gy 单次照射;FC:变化倍数。 表 1 小鼠经X线全肺野照射后MD、HD组最显著共同表达基因的信息
Table 1. The most significant co-expression genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups after whole lung X-ray irradiation in mice
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梯度剂量照射后肺组织基因芯片结果显示,3个特征性上调表达基因(Phlda3、Fgg、Kng1)均随X射线剂量的增加而表达增强;2个特征性下调表达基因(Ptprb、Kit)则随剂量的上升而表达降低(图3中A)。这一结果与单次照射实验结果一致,提示该基因标志物组合对不同剂量、不同分次X射线照射均具有较强的辐射敏感性。上调基因(Phlda3、Fgg、Kng1)的平均值通过逻辑回归模型建模,模型拟合程度较高(χ2=11.66, R2=0.88)(图3中B)。下调基因(Ptprb、Kit)进行线性回归分析后结果显示,下调基因表达水平与X射线剂量呈明显负相关(R=−0.95,R2=0.89)(图3中C)。
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对MD组和HD组小鼠基因表达水平进行KEGG通路基因集富集分析,结果显示2组小鼠上调表达差异基因在p53、氧化磷酸化等多条信号通路出现富集(图4中A),这提示X射线照射后小鼠肺部可能出现上述信号通路上调。p53信号通路先导基因分析结果显示,MD、HD组分别有23个、26个基因的上调表达对p53信号通路上调产生作用(图4中B、C)。
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对HD组小鼠基因表达水平进行基因本体论生物学功能基因集富集分析,结果显示上调基因富集于固有免疫反应激活生物学过程(图5中A),下调基因则富集于肺部发育和气管发育等生物学过程(图5中B、C)。先导基因分析结果显示,49个基因的上调表达对激活固有免疫反应生物学过程产生作用,分别有11个基因、12 个基因的下调表达对抑制肺泡发育及肺细胞分化的生物学过程产生作用。
放射性肺损伤小鼠晚期转录水平特征性基因标志物的研究
Transcriptional investigation of biomarkers for late radiation-induced lung toxicity in mice
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摘要:
目的 研究不同剂量X射线照射小鼠肺部后的差异基因并进行转录水平分析,探讨小鼠放射性肺损伤(RILI)潜在的基因标志物。 方法 8周龄C57BL6雌性小鼠96只,X射线单次照射分为3组(12只/组):对照组(未接受照射)、中等剂量组(MD组,10 Gy单次照射)、高剂量组(HD组,20 Gy单次照射),余60只分为5组进行X射线全肺野梯度剂量照射。采用全基因组表达芯片对小鼠肺组织进行RNA检测并生成基因表达矩阵,使用R语言软件包进行基因表达数据转换,对特征性基因标志物表达水平进行验证与数学建模,对HD组小鼠基因表达水平进行基因本体论生物学功能基因集富集分析。采用经典贝叶斯检验方法进行组间基因表达差异的比较,采用线性回归模型分析2组独立数据的关联程度(关联系数为R2)。 结果 MD组和HD组小鼠照射后肺组织转录组学分析,共筛选出RILI差异表达基因539个,其中差异最显著的5个基因为Phlda3、Fgg、Kng1(上调基因)和Ptprb、Kit(下调基因)。梯度剂量X射线分次照射实验结果证实,3个上调基因均随X线剂量的增加而表达增强;2个下调基因则随剂量的上升而表达降低。上调基因的逻辑回归模型拟合程度较高(χ2=11.66, R2=0.88);下调基因的表达值与剂量具有良好的相关性(R=−0.95,R2=0.89)。基因集富集分析结果显示,上调基因富集于p53信号通路、固有免疫反应等生物学过程,下调基因富集于细胞代谢、肺部发育等生物学过程。 结论 上调基因Phlda3、Fgg、Kng1与下调基因Ptprb、Kit可作为客观反应RILI严重程度的潜在基因标志物,为日后开展临床与辐射防护相关应用奠定前临床基础。 Abstract:Objective To investigate differentially regulated genes after whole thoracic X-ray exposure and to explore the potential gene markers at transcriptome levels of radiation-induced lung injury (RILI) at transcriptome levels in mice. Methods A total of 96 C57BL6 female mice aged 8 weeks were divided into three groups by single X-ray irradiation, namely. control group (no irradiation), medium dose group (MD group, 10 Gy single irradiation), and high dose group (HD group, 20 Gy single irradiation). Whole thoracic X-ray irradiation was delivered to the remaining 60 mice with a wide range of doses and fractionations. Whole genome expression chips were used in the detection of RNA in mouse lung tissues and gene expression data were converted by the R language software. Classical Bayesian test was used in exploring differentially expressed genes between groups. The expression levels of key genes were validated and mathematically analyzed, and gene ontology biological function enrichment analysis was performed. The correlation degree between two groups with independent data was analyzed by regression model (correlation coefficient is R2). Results According to medium vs. high dose irradiations, the differentially regulated genes(539 genes) were selected. Then, the top five most significant genes were identified, namely, Phlda3, Fgg, Kng1 (up-regulated genes) and Ptprb, Kit (down-regulated genes). Dose escalation studies confirmed that the transcriptional status of the five gene signatures correlated well with radiation doses. The expression levels of the three up-regulated genes increased with the boost of X-ray dose (logistic regression model χ2=11.66, R2=0.88); whereas the expression levels of the two down-regulated genes decreased with the boost in X-ray dose (linear regression R=−0.95, R2=0.89). Gene set enrichment analysis revealed that up-regulated genes were associated with p53 signaling and innate immune response; whereas the down-regulated genes were enriched in biological processes, such as cell metabolism and lung development. Conclusions Up-regulated genes Phlda3, Fgg, Kng1, as well as the down-regulated genes, Ptprb and Kit, can be used as potential genetic markers to indicate the severity of RILI. This finding sheds light on the mechanism involved in the radiation protection evidenced by mRNA biomarkers. -
Key words:
- X-Rays /
- Radiotherapy dosage /
- Radiation-induced lung injury /
- Transcriptome /
- Biomarkers
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表 1 小鼠经X线全肺野照射后MD、HD组最显著共同表达基因的信息
Table 1. The most significant co-expression genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups after whole lung X-ray irradiation in mice
基因名称 表达 MD组 HD组 基因功能 log2(FC) P值 log2(FC) P值 PH同源域家族A成员3 上调 1.02 0.000 1.36 0.000 作为p53的直接靶点,抑制Akt蛋白活性,增强细胞凋亡。 纤维蛋白原γ链 上调 1.12 0.000 2.04 0.004 通过增强血小板P-选择素表达,在炎症、血栓形成和止血过程中发挥作用。 激肽原1 上调 1.69 0.000 3.91 0.000 具有激肽原生理功能,促进炎症因子释放、抑制血小板聚集。 蛋白质酪氨酸磷酸酶,B型受体 下调 −1.30 0.000 −1.32 0.000 在血管生成和血管重塑过程中发挥重要作用。 KIT原癌基因受体酪氨酸激酶 下调 −1.30 0.000 −1.32 0.000 通过磷酸化PIK3R1激活AKT1信号通路,抑制细胞凋亡。 注:表中,MD组:10 Gy 单次照射;HD组:20 Gy 单次照射;FC:变化倍数。 -
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